Rongorongo

Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Ko te putanga pūtirotiro e whakamahia ana e koe he iti te tautoko CSS.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tenei wa, hei whakarite i te tautoko tonu, ka tukuna e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Ko nga tikanga tapanga tata enzymatic i runga i nga esters kua whakahohehia, i nga rauropi phenoxy ranei e whakamahia nuitia ana ki te mapi i nga poroteima subcellular me nga tauwhitiwhiti pūmua i roto i nga pūtau ora.Heoi ano, he iti ake te hohenga o nga hākawa whakahohe, ka puta mai he whanui tapanga, a ka taea e nga tuwhenawhe phenoxy i hangaia e te maimoatanga peroxide te whakararu i nga ara redox.I konei ka ripoatahia e matou he tikanga whakangao-whakaahua-a-ringa-a-taatata (PDPL) i hangaia ma te hono-a-ira te pūmua miniSOG photosensitizer ki te pūmua whai hua.Na te rama kikorangi me te whakahaere i te wa whakamohiotanga, ka hangaia te hāora kotahi katahi ka whakatauhia te tapanga mokowhiti mo nga toenga histidine e te rangahau aniline.Ka whakaatuhia e matou tona tino pono ma te mapi poroteome motuhake o te organelle.Ko te whakataurite taha-taha o te PDPL me te TurboID e whakaatu ana i te waahanga proteomic motuhake me te matawhānui o PDPL.I muri mai, ka tono matou i te PDPL ki te coactivator transcriptional BRD4 me te E3 Parkin ligase e pa ana ki te mate, a, ka kitea nga kaitautoko kaore i mohiotia i mua.Na roto i te whakamaaramatanga o te whakamaaramatanga, e rua nga taputapu kaore e mohiotia, ko Ssu72 me SNW1, i tohuhia mo Parkin, ko tana whakahekenga e takawaengahia ana e te ara ubiquitination-proteasome.
Ko te tohu tika o nga kupenga pūmua kei raro i te maha o nga tukanga pūkoro taketake.Na reira, ko te mapi mokowhiti tino tika o nga taunekeneke pūmua ka whakarato i te kaupapa ngota mo te whakamaarama i nga huarahi koiora, te mate mate, me te whakararu i enei taunekeneke mo nga kaupapa rongoa.Mo tenei mutunga, ko nga tikanga e taea ai te kite i nga taunekeneke i roto i nga waahi ora, i nga kopa ranei e tino hiahia ana.Ko te Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) i whakamahia i mua ki te tautuhi i nga hoa hono o nga pūmua whai hua (POI).Na te whakawhanaketanga o nga tikanga proteomic ine, i hangaia a Bioplex3.0, te putunga nui rawa atu o nga whatunga pūmua i runga i te AP-MS.Ahakoa he tino kaha te AP-MS, ko te lysis o te pūtau me te dilution i roto i te rerenga mahi he rītaha ki te ngoikore me te nohotahi te tauwhitiwhiti here me te whakauru i nga taonga whai muri i te lysis penei i nga takirua tauwhitiwhiti tinihanga kaore he wehewehenga i mua i te lysis.
Hei whakatika i enei take, kua whakawhanakehia nga waikawa amino kore maori (UAA) me nga roopu honohono me nga papaaa tohu whakangao (PL) tata (hei tauira APEX me BioID)5.Ahakoa kua pai te whakamahi i te tikanga UAA i roto i nga ahuatanga maha me te whakarato korero mo nga whakapiringa pūmua tika, me arotau tonu te waahi whakauru UAA.Ko te mea nui, he tikanga tapanga stoichiometric karekau he hurihanga whakahuri o nga takahanga tapanga.He rereke, ko nga tikanga PL enzymatic, penei i te tikanga BioID, ka hono i te hononga biotin i hangaia ki te POI7, ka whakahohe i te koiora hei hanga i te takawaenga haukawa biotinyl-AMP tauhohenga.Na te enzyme e whakakorikori me te tuku i te "kapua" biotin kua whakahohehia e tohu ana i nga toenga lysine tata.Heoi, me neke atu i te 12 haora te roa o te BioID kia whiwhi tohu tapanga rawaka, e aukati ana i te whakamahi me te whakatau i te waa.Ma te whakamahi i te kukuwhatanga i runga i te whakaaturanga rewena, i hangaia a TurboID i runga i te BioID kia pai ake, kia pai ai te tapanga me te biotin i roto i te 10 meneti, kia kaha ake te ako i nga tukanga hihiri.Na te mea he kaha te kaha o te TurboID, a he ranea nga taumata biotin endogenous mo te tapanga taumata-iti, ka raru pea te tapanga papamuri ina hiahiatia te tapanga whakanikoniko me te wa e tika ana ma te taapiri o te biotin o waho.I tua atu, he kino te hohenga o nga hākawa whakahohe (t1/2 ~ 5 min), ka puta ki te radius tapanga nui, ina koa i muri i te waiwai o nga pūmua tata ki te biotin 5. I tetahi atu huarahi, ko te whakakotahitanga ira o te peroxidase ascorbate i hangaia (ara ko te biotin- phenol radicals a ka taea te tapanga pūmua i roto i te meneti9,10. Kei te whakamahia nuitia te APEX ki te tautuhi i nga proteomes subcellular, te membrane pūmua matatini, me te cytosolic signaling protein complexes11,12. Heoi, ko te hiahia mo te nui o nga peroxides ka pa ki nga pūmua redox, ara ranei, ka pakaru ngā tukanga pūtau.
No reira, ko tetahi tikanga hou e kaha ana ki te whakaputa i nga momo pehanga kua tapaina-radius me te tika o te mokowā me te waahi me te kore e tino whakararu i nga huarahi pūkoro ka waiho hei taapiri nui ki nga tikanga o naianei. I roto i nga momo tauhohenga, ko te hāora kotahi i oho to tatou aro na te poto o te wa e ora ana me te iti o te radius diffusion (t1/2 <0.6 µs i roto i nga pūtau)13. I roto i nga momo tauhohenga, ko te hāora kotahi i oho to tatou aro na te poto o te wa e ora ana me te iti o te radius diffusion (t1/2 <0.6 µs i roto i nga pūtau)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограснически и ограгничесть/6 миндиф. I roto i nga ahua kaha, ko te hāora kotahi te mea i aro mai na te poto o tona oranga me te iti o te radius diffusion (t1/2 <0.6 µs i roto i nga ruma)13.在活性物质中，单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 < 0.6 µs）的走他们我们一们。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограница и ограници / 6 злодный кислород. I roto i nga ahua kaha, ko te hāora kotahi te kukume i to tatou aro na te mea he poto tona oranga me te iti o te radius diffusion (t1/2 <0.6 μs i roto i nga pūtau).Ko te hāora kotahi te korero ki te oxidize matapōkeretia te methionine, te tyrosine, te histidine me te tryptophan, ka waiho hei polar 14,15 mo te taapiri ki te amine, ki te thiol-based probes16,17.Ahakoa kua whakamahia te hāora kotahi ki te tapanga i te wahanga pūtau-roto RNA, ko nga rautaki mo te whakahoki ano i nga tohu tata POI endogenous kare tonu i te tirotirohia.I konei, ka whakaatuhia e matou he papanga e kiia nei ko te tapanga tata e whakawhirinaki ana ki te whakaahua (PDPL), ka whakamahi matou i te rama kikorangi ki te whakamarama i nga POI kua honoa ki te miniSOG photosensitizer me te whakaoho i te whakangao hāora kotahi ki te whakapouri i nga toenga tata, ka whai i nga whakarereketanga kei roto amine hei whakamomori i nga rangahau matū ki roto. ngā pūtau ora takawaenga..I whakamatauria e matou he roopu rangahau matū hei whakanui ake i te tohu motuhake me te tautuhi i nga waahi whakarereke ma te whakamahi i te rerenga mahi proteomic tuwhera.Ko te whakataurite taha-taha o te PDPL me te TurboID e whakaatu ana i te waahanga proteomic motuhake me te matawhānui o PDPL.I whakamahia e matou tenei huarahi ki nga tohu okana-motuhake o te proteome subcellular me te tohu porotiki whanui o nga hoa here mo te mate pukupuku epigenetic regulatory protein BRD4 me te E3 ligase Parkin e pa ana ki te mate o Parkinson, i whakapumau i te hononga mohio me te whatunga o te pūmua. taunekeneke..Ko te kaha o te PDPL ki te mohio ki nga taputapu E3 i roto i nga kohinga pūmua nui e tohu ana i tetahi ahuatanga e hiahiatia ana kia mohiohia nga hononga here.E rua nga taputapu parkin e kore e mohiotia i takawaengahia e te ubiquitination-proteasome kua whakapumautia i te waahi.
Ko te whakamaaramatanga Photodynamic (PDT)19 me te whakakorenga taiaho-a-awhi-a-chromophore (CALI)20, i roto i te whakamaaramatanga marama me nga kaiwhakaahua whakaahua ka whakaputa i te hāora kotahi, ka taea te whakakore i nga pūmua whainga, ka mate ranei nga pūtau.I te mea ko te hāora kotahi he matū tino tauhohenga me te tawhiti whakamaoritanga ariā tata ki te 70 nm, ka taea te whakahaere i te hauhautanga mokowhiti huri noa i te whakaahua.I runga i tenei ariā, i whakatau matou ki te whakamahi i te hāora kotahi hei whakatutuki i te tapanga tata o nga matatini pūmua i roto i nga pūtau ora.Kua whakawhanakehia e matou he huarahi chemoproteomic PDPL ki te whakatutuki i nga mahi e wha: (1) ki te whakakorikori i te whakatipuranga o te hāora kotahi te kaha rite ki te huarahi enzymatic PL;(2) whakarato tapanga kua whakatauhia i runga i te tiimata marama;(3) ma te whakarereketanga (4) A ape i te whakamahi i nga cofactors endogenous (pēnei i te biotin) hei whakaiti i te papamuri, te whakamahi ranei i nga reagents exogenous tino raruraru (pēnei i te peroxide) hei whakaiti i te toronga o te pūtau ki te ahotea taiao.
Ka taea te wehea nga whakamaarama whakaahua ki nga waahanga e rua tae atu ki nga fluorophores iti ngota ngota (hei tauira, rose bengal, methylene blue)22 me nga pūmua iti kua whakawaeherehia ira (hei tauira, miniSOG, KillerRed)23.Hei whakatutuki i te hoahoa modular, i whakawhanakehia e matou te reanga tuatahi o te papaaapapa PDPL ma te taapiri i nga pūmua photosensitizer (PS) ki te POI24,25 (Whakaahua 1a).Ina rarahia ki te rama kikorangi, ka whakahaorahia e te hāora singlet nga toenga waikawa amino nucleophilic tata, ka puta he polarity umpolung he electrophilic ka taea ano te tauhohe me te nucleophiles probe amine16,17.I hoahoatia te rangahau me te kakau alkyne kia paato te matū ka kumea ki raro mo te tohu LC/MS/MS.
He whakaahuatanga mo te tapanga o nga matatini pūmua i takawaenga e miniSOG.Ka pa ana ki te marama kikorangi, ka whakaputa nga pūtau e whakaatu ana i te miniSOG-POI i te hāora kotahi, e whakarereke ana i nga pūmua tauwhitiwhiti engari ehara i nga pūmua here kore.Ko nga hua takawaenga o te photooxidation ka haukotia e nga tapanga rei o te rangahau matū amine ki te hanga i nga taapiri kovalent.Ko te roopu alkynyl i runga i te rangahau matū ka taea te paato i te matū hei whakarangatira ma te kume-iho ka whai i te inenga LC-MS/MS.b Hanganga matū o nga rangahau amine 1-4.c Ko te wetewete o te reera rewharewha o nga tohu proteomic-mediated miniSOG i te rohe e whakamahi ana i nga rangahau 1-4 me te inenga whanaunga i runga i te densitometry gel.Ko te ōwehenga tohu-ki-papamuri o nga rangahau matū i aromatawaihia ma te whakamahi i nga whakamatautau whakahaere kino haunga te rama kikorangi, te whakamahi ranei i nga pūtau HEK293T me te kore korero miniSOG.n = 2 tauira motuhake koiora.Ko ia ira he tohu mo te tauira koiora.d Te kimi kanohi me te inenga o te PDPL ma te whakamahi i te rangahau papaitia 3 i te aroaro, i te ngaro ranei o nga waahanga PDPL kua tohua penei c.n = 3 tauira motuhake koiora.Ko ia ira he tohu mo te tauira koiora.Ko nga raina waenga me te pawai e tohu ana i te toharite me te ± inenga paerewa.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Atahanga whakahiato o te hāora kotahi me te poke Si-DMA tino whero.Pae tauine: 10 µm.Ko te atahanga kiri me nga whakamatautau confocal i tukurua takitahi i te iti rawa kia rua me nga hua rite.
I whakamatauria tuatahitia e matou te kaha o nga kaiwhakaahua whakaahua pakeke miniSOG26 me te KillerRed23, kua tino whakaatuhia i roto i te HEK293T, ki te takawaenga i te tapanga propargylamine o te proteome hei tirotiro matū (Taupiri Fig. 1a).I whakaatuhia e te tātaritanga o te kaera karekau he hua tapanga i kitea me te KillerRed.Hei whakapai ake i te ōwehenga tohu-ki-papamuri, ka whakamatauhia e matou he huinga rangahau matū kei roto te aniline (1 me te 3), propylamine (2), benzylamine (4) ranei.I kite matou ko nga pūtau HEK293T ake he tohu papamuri teitei ake ki te kore he rama kikorangi, tera pea na te riboflavin photosensitizer endogenous, flavin mononucleotide (FMN) 27. Ko nga rangahau matū-a-aniline 1 me te 3 he pai ake te korero, me te HEK293T e tino whakaatu ana i te miniSOG i roto i te mitochondria e whakaatu ana i te > 8-tiki te piki ake o te tohu mo te tirotiro 3, ko te tirotiro 2 i whakamahia i roto i te tikanga tapanga-RNA CAP-seq anake e whakaatu ana ~2.5- ka piki ake te tohu tohu, na te rerekee o nga hiahia tauhohenga i waenga i te RNA me te pūmua (Fig. 1b, c). Ko nga rangahau matū-a-aniline 1 me te 3 he pai ake te korero, me te HEK293T e tino whakaatu ana i te miniSOG i roto i te mitochondria e whakaatu ana i te > 8-tiki te piki ake o te tohu mo te tirotiro 3, ko te tirotiro 2 i whakamahia i roto i te tikanga tapanga-RNA CAP-seq anake e whakaatu ana ~2.5- ka piki ake te tohu tohu, na te rerekee o nga hiahia tauhohenga i waenga i te RNA me te pūmua (Fig. 1b, c).Ko nga rangahau matū a-aniline 1 me te 3 i whakaatu pai ake: HEK293T, e tino whakaatu ana i te miniSOG i roto i te mitochondria, e whakaatu ana i te neke atu i te 8 nga pikinga o te tohu mo te tirotiro 3, i te tirotiro 2, i whakamahia i roto i te tikanga tapanga CAP-seq RNA, anake e whakaatu ana ~ 2.5-fold te piki o te tohu, tera pea na te rereke o nga hiahia tauhohenga i waenga i te RNA me te pūmua (Fig. 1b, c).基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 具有具有 好 的 特异性, Hek293t 在 线2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b，c）。基于 苯胺 的 化学 探针 1 和 3 具有 具有 更 的 特异性, Hek293t 在 粒体 中 稳定稳定 表达 3 的 信号 增加 增加> 8 倍 而而 于 于 的 标记 标记 Cap-eq ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ -倍信号增加，可能是由于RNAKo nga rangahau matū a-aniline 1 me te 3 he pai ake te motuhake, HEK293T i tino whakaatu te miniSOG i roto i te mitochondria, a ko te rangahau 3 i neke atu i te 8 nga pikinga o te tohu, ko te tirotiro 2 mo te tikanga tapanga RNA CAP-seq i whakaatu noa ~2.5 -fold te pikinga.i roto i te tohu, he rereke pea nga manakohanga tauhohenga i waenga i te RNA me te pūmua (Fig. 1b, c).I tua atu, i whakamatauhia te tirotiro 3 inerite me te hydrazine probes (probes 5, 6, 7), e whakau ana i te arotautanga o te tirotiro 3 (Taupiri Fig. 1b,c).Waihoki, i kitea e te wetewete o te kiri-kiri etahi atu tawhā whakamätautau kua arotauhia: te roangaru o te ira (460 nm), te kukū o te rangahau matū (1 mM), me te wa whakamaarama (20 min) (Taupiri Fig. 2a–c).Ko te whakakore i tetahi waahanga, i tetahi taahiraa ranei i roto i te kawa PDPL ka puta he tohu nui te hurihanga ki te papamuri (Fig. 1d).Otirā, i tino whakahekehia te tapanga pūmua i te aroaro o te konutai azide, trolox ranei, e mohiotia ana hei tinei i te hāora kotahi.Ko te aroaro o D2O, e mohiotia ana ki te whakapumau i te hāora kotahi, ka whakanui i te tohu tapanga.Hei whakatewhatewha i te takoha o etahi atu momo hāora tauhohenga ki te tapanga, i tapirihia te mannitol me te huaora C ki te whakatu i nga kaikawe hauwai me te superoxide radical scavengers, 18, 29, engari kaore i kitea he whakaiti i te tapanga.Ko te taapiri o te H2O2, engari kaore i te whakamarama, kaore i puta te tapanga (Taapiri Whakaatu 3a).Ko te whakaata o te hāora singlet singlet me nga rangahau Si-DMA i whakapumau i te noho o te hāora kotahi i roto i te waea HEK293T-miniSOG, engari kaore i te waea HEK293T taketake.I tua atu, kaore i taea e te mitoSOX Whero te kite i te hanga superoxide i muri i te whakamaramatanga (Fig. 1e me te Whakaaturanga Tāpiri. 3b) 30. Ko enei raraunga e tino tohu ana ko te oxygen singlet te momo oxygen reactive matua e whai kawenga ana mo te tapanga proteomic o muri mai.I aromatawaihia te Cytotoxicity o te PDPL tae atu ki te whakamarama marama puru me nga rangahau matū, a kaore i kitea he cytotoxicity nui (Taupiri Fig. 4a).
Hei ako i te tikanga tapanga me te whakaahei i te tautuhi proteomic o nga matatini pūmua ma te whakamahi i te LC-MS/MS, me whakatau tuatahi ko wai nga waikawa amino ka whakarereke me te papatipu delta o nga tapanga rangahau.Ko te methionine, te histidine, te tryptophan me te tyrosine kua panuitia ka whakarereketia e te oxygen singlet14,15.Ka tuituia e matou te rerengamahi TOP-ABPP31 me te rapunga tuwhera kore noa e whakaratohia ana e te papa rorohiko FragPipe i runga i MSFragger32.Whai muri i te whakarerekētanga o te hāora kotahi me te tapanga rangahau matū, ka mahia te panui matū ma te whakamahi i te tapanga whakaheke koiora kei roto he hononga hono, whai muri ko te toronga neutravidin me te keri trypsin.Ko te peptide kua whakarereketia, kua herea tonu ki te kapia, he whakaahua mo te tātaritanga LC-MS/MS (Whakaahua 2a me te Raraunga Tāpiri 1).He maha nga whakarereketanga i puta puta noa i te proteome me te neke atu i te 50 nga mapi peptide (PSM) kua tohua (Fig. 2b).He mea whakamiharo, i kite noa matou i te whakarereketanga o te histidine, na te kaha ake o te tauhohenga o te histidine oxidized ki nga rangahau aniline i era atu waikawa amino.E ai ki te tikanga whakaputa o te waikura histidine na roto i te hāora kotahi,21,33 ko te hanganga delta-papatipu o te +229 Da e rite ana ki te whakaurunga o te rangahau 3 me te 2-oxo-histidine i muri i te rua o nga waikura, ko te +247 Da ko te hua hydrolysis. o +229 Da (Taupiri Fig. 5).Ko te aromatawai o te awhi MS2 i whakaatu i te tino pono o te tautuhi i te nuinga o nga katote y me te b, tae atu ki te tautuhi i nga katote wehenga kua whakarereketia (y me te b) (Fig. 2c).Ko te tātaritanga o te horopaki o te raupapa rohe o nga histidines kua whakarerekehia e te PDPL i whakaatu i te hiahia motika motika mo nga toenga hydrophobic iti i nga waahi ± 1 (Taupiri Fig. 4b).I te toharite, 1.4 histidines i tautuhia mo ia pūmua, a, ko nga waahi o enei tohu i whakatauhia e te waahi o te mata e uru ana ki te whakarewa (SASA) me te waahi o te whakarewa (RSA) te waahanga (Taupiri Fig. 4c, d).
He rerengamahi kore noa mo te ako i te toenga whiriwhiri ma te whakamahi i te papa rorohiko FragPipe e whakakahangia ana e MSFragger.Ka whakamahia nga hononga hono ki te Click chemistry kia taea ai te tango whakaahua o nga peptides whakarereke mai i te kapia streptavidin.I whakarewahia he rapunga tuwhera ki te tautuhi i nga whakarereketanga maha, me nga toenga whai take.b Tautapahia te papatipu o nga whakarereketanga puta noa i te poroteome.Peptide mapi PSM.c MS2 whakamohiotanga matakite o nga waahi histidine i whakarereketia ki te rangahau 3. Hei tauira, he tauhohenga kowauwao me te rangahau 3 i taapiri +229.0938 Da ki te waikawa amino kua whakarereketia.d Whakatau irirangi i whakamahia hei whakamatautau mo nga tohu PDPL.Ko te PRDX3 (H155A, H225A) me te PRDX1 (H10A, H81A, H169A) i whakawhitia me nga momo plasmids mohoao mo te kitenga anti-Flag.e I tauhohehia te peptide waihanga ki te miniSOG kua purea i te aroaro o te rangahau 3 me nga hua e rite ana ki te Δm +247 me +229 i tuhia i roto i te LC-MS spectrum.f In vitro pūmua-ki-pūmua pāhekoheko whakatauira ki te miniSOG-6xHis-tag me te anti-6xHis antibody.Antibiotin (streptavidin-HRP) me te wetewete kiore kiore Western o te miniSOG-6xHis/anti-6xHis matatini antibody kua tapaina ki te tirotiro 3, i runga i te wa o te rongo ki te marama.Ko nga tapanga mo nga pūmua takitahi e whakaatuhia ana i roto i te taumahatanga ngota e rite ana: LC antibody light chain, HC antibody heavy chain.Ko enei whakamatautau i tukuna takitahi i te iti rawa kia rua me nga hua rite.
Mo te manatoko matū koiora o te waahi tapanga, ko te PRDX3 me te PRDX1 i tautuhia e te spectrometry papatipu i hurihia mai i te histidine ki te alanine me te whakataurite ki te momo mohoao i roto i nga whakamatautau whakawhiti.Ko nga hua o te PDPL i whakaatu ko te whakarereketanga i tino heke te tapanga (Fig. 2d).I taua wa, ko nga raupapa peptide i tautuhia i roto i te rapu tuwhera i whakahiatohia me te urupare i roto i te vitro me te miniSOG kua purea i te aroaro o te probe 3 me te marama puru, ka whakaputa hua me te nekehanga papatipu o +247 me +229 Da ka kitea e LC-MS (Fig .2e).).Hei whakamatautau mehemea ka taea te tapanga i roto i te in vitro te taunekeneke ki nga pūmua tata hei whakautu ki te miniSOG photoactivation, i hangaia e matou he whakamatautau tata hangai ma te taunekeneke i waenga i te miniSOG-6xHis pūmua me te anti-His monoclonal antibody in vitro (Whakaahua 2f).I roto i tenei whakamatautau, i whakaarohia e maatau te tapanga tata o nga mekameka taumaha me te maama me te miniSOG.Ko te tikanga, ko te anti-kiore (te mohio ki nga mekameka taumaha me te maamaa o te antibody anti-6xHis-labeled) me te streptavidin Western blots i whakaatu te kaha biotinylation o nga mekameka taumaha me te maama.Ko te mea nui, i kite matou i te miniSOG autobiotinylation na te tohu 6xHis me nga hononga-whakawhitinga i waenga i nga mekameka marama me te taumaha, tera pea e pa ana ki te waahi i whakaahuahia i mua i waenga i te lysine me te 2-oxo-histidine whakautu tata.Hei whakamutunga, ka whakatauhia e PDPL te whakarereke i te histidine i runga i te ahua tata.
Ko ta matou whainga i muri mai ko te tohu i te proteome subcellular hei whakamatautau i te motuhake o te tapanga in situ.Na reira, i tino whakaatuhia e matou te miniSOG i roto i te karihi, mitochondrial matrix, o waho ranei ER membrane o HEK293T (Fig. 3a).I kitea e te tātaritanga o te rewharewha te maha o nga roopu tapanga i nga waahi iti e toru me nga tauira tapanga rereke (Fig. 3b).Ko te tātari atahanga fluorescence i whakaatu i te tino motuhake o te PDPL (Fig. 3c).Ko te rerengamahi PDPL i whai i nga tauhohenga paato me nga waikano rhodamine ki te tohu i nga proteomes subcellular ma te whakamahi i te microscopy fluorescence, me nga tohu PDPL i colocalized ki DAPI, mitochondrial trackers, ER trackers ranei, e whakau ana i te tino pono o te PDPL.Mo nga waahi okana e toru, ko te whakataurite taha-taha o te PDPL me te TurboID e whakamahi ana i te avidin western blot i whakaatu ko te PDPL i tapaina ake ki a raatau ake mana whakahaere.I raro i nga tikanga PDPL, he maha atu nga roopu tapanga i puta, e tohu ana i te maha atu o nga pūmua kua tapaina ki te PDPL (Taapiri Pikitia 6a-d).
he whakaaturanga Ahangahanga mo te tapanga proteome motuhake-whakawaenga-miniSOG.Ko te miniSOG e whai ana i te matrix mitochondrial ma te whakakotahi ki te N-terminal 23 waikawa amino o te tangata COX4 (mito-miniSOG), te karihi ma te whakakotahi ki te H2B (nucleus-miniSOG), me te Sec61β ma te taha cytoplasmic o te membrane ER (ER-miniSOG). ).Ko nga tohu ko te whakaahua reera, te atahanga confocal, me te spectrometry papatipu.b Ko nga whakaahua rei kanohi mo nga whakaaturanga PDPL e toru o nga organelle-motuhake.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Ko nga whakaahua whakapouri o nga pūtau HEK293T e whakaatu mau ana i te miniSOG me nga momo waahi-a-roto i kitea e te antibody tapanga V5 (whero).Ka whakamahia nga tohu subcellular mo te mitochondria me te ER (matomato).Kei roto i te rerengamahi PDPL te kitenga o te miniSOG (kowhai) kua tapaina nga poroteima subcellular ma te whakamahi matū paato a Cy3-azide.Pae tauine: 10 µm.d Nga papa puia o nga poroteoma kua tohuhia e te PDPL i roto i nga momo okana kua inehia e te inenga kore tapanga (n = 3 nga whakamatautau koiora motuhake).I whakamahia te whakamātautau-t a te tauira-rua ki runga i nga papa puia.HEK293T momo mohoao i whakamahia hei mana kino. Ko nga pūmua kua tino rerekee kua tohua ki te whero (p <0.05 me >2-fold te rereketanga o te kaha o te katote). Ko nga pūmua kua tino rerekee kua tohua ki te whero (p <0.05 me >2-fold te rereketanga o te kaha o te katote). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ko nga pūmua tino rerekee kua tohua ki te whero (p <0.05 me > 2-fold te rereketanga o te kaha o te katote).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Ko nga pūmua tino rerekee kua tohua ki te whero (p <0.05 me > 2-whakarereketanga o te kaha katote).Ko nga pūmua e pa ana he mea nui mo HEK293T-miniSOG engari ehara i te mea nui mo HEK293T ka whakaatuhia ki te matomato.e Te tātaritanga o te motuhake o nga huingararaunga proteomic mai i nga whakamatautau d.Ko te tapeke o nga pūmua tauanga nui o ia okana (nga ira whero me te kaakaariki) kua tohua ki runga.Ko nga tohu tohu tohu e whakaatu ana i nga pūmua kei roto i nga okana i runga i te MitoCarta 3.0, GO tātaritanga me A. Ting et al.tangata.Whakawehea nga huingararaunga mo te mitochondria, karihi, me te ER.Ko enei whakamatautau i tukuna takitahi i te iti rawa kia rua me nga hua rite.Ka whakaratohia nga raraunga mata ki te ahua o nga konae raraunga mata.
I whakatenatenahia e te reera me nga hua whakaahua, i whakamahia te inenga kore-tapanga hei ine i te proteome kua tautuhia i roto i ia okana (Raraunga Tāpiri 2).I whakamahia te HEK293T kaore i whakawhitia hei mana kino ki te tango i nga tohu papamuri. Ko te tātaritanga papa puia i whakaatu i nga pūmua tino whakarangatira (p <0.05 me >2-fold te kaha o te katote) tae atu ki nga pūmua kotahi kei roto noa i nga raina whakaputa-miniSOG (Fig. 3d ira whero me te matomato). Ko te tātaritanga papa puia i whakaatu i nga pūmua tino whakarangatira (p <0.05 me >2-fold te kaha o te katote) tae atu ki nga pūmua kotahi kei roto noa i nga raina whakaputa-miniSOG (Fig. 3d ira whero me te matomato). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). I whakaatuhia e te tātaritanga papa puia nga pūmua tino whakarangatira (p<0.05 me >2-fold te kaha o te katote) tae atu ki nga pūmua kotahi kei roto noa i nga raina whakaputa-miniSOG (Fig. 3d, ira whero me te matomato).火山图 分析分析 出出 的 的 蛋白质 (p <0.05 和> 2 倍 离子 强度) 以及 仅 存 在于 在于 mimisog 表达 系 中 的 单一 蛋白质 (图 3d 红色 和和).火山图 分析 显示 出 显着 的 蛋白质 （p <0.05 和> 2 倍 离子 强度） 仅 存 在于 在于 minisog 表达 系 的 单一 蛋白质 （图 3d 红色 绿色点。。。）））））））））） Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). I kitea e te tātaritanga papa puia nga pūmua tino whakarangatira (p<0.05 me >2x te kaha katote) tae atu ki nga pūmua kotahi kei roto anake i te raina whakapuaki miniSOG (nga ira whero me te kaakaariki i te Whakaahua 3d).Ko te whakakotahi i enei raraunga, i tautuhia e matou te 1364, 461, me te 911 te nui o te karihi karihi, te mitochondrial, me te ER o waho o nga pūmua membrane.Hei tātari i te tika o te organelle-localized PDPL, i whakamahia e matou te MitoCarta 3.0, Gene Ontology (GO) tātaritanga, me A. Ting et al.he huinga raraunga8 i whakamahia mo te mitochondria, te karihi, me te ER hei whakamatautau i te motuhake o te organelle o nga pūmua kua kitea, e rite ana ki te tika o te 73.4, 78.5, me te 73.0% (Fig. 3e).Ko te motuhake o te PDPL e whakapumau ana ko te PDPL he taputapu pai mo te tautuhi i nga proteome motuhake-a-orga.Ko te mea nui, ko te tātaritanga submitochondrial o nga pūmua mitochondrial kua tautuhia i whakaatu ko te poroteome kua mau i te nuinga o te tohatoha i roto i te matrix me te membrane o roto (226 me te 106, ia), e 91.7% (362) o te tapeke o nga pūmua mitochondrial kua tautuhia.he taumata teitei o te PDPL i whakapumautia (Taupiri Fig. 7a).Waihoki, ko te tātaritanga subnuclear i whakaatu ko te proteome i mau i te nuinga o te tohatoha i roto i te nucleus, nucleoplasm, me te nucleolus (Taupiri Fig. 7b).Ko te tātari proteomic karihi me te peptide tohu tohu karihi karihi (3xNLS) i whakaatu rite te tika ki te hanga H2B (Taupiri Fig. 7c-h).Hei whakatau i te motuhake o te tohu PDPL, i kowhiria te laminin karihi A hei mahanga POI7 ake ake.I tautuhia e PDPL 36 nga pūmua tino whakarangatira, ko te 12 nga pūmua (30.0% tae atu ki te lamin A) he pai te tohu o te lamin A nga pūmua taunekeneke i tuhia e te String database, he nui ake te ōrau i te tikanga BioID (122 pūmua) 28 o 28. , 22.9 %) 7. I kitea e ta matou tikanga he iti ake nga pūmua, na te iti o nga waahi tapanga, na te kaha ake o te hāora kotahi.Ko te tātaritanga GO i whakaatu ko nga pūmua kua tautuhia ko te nuinga kei roto i te nucleoplasm (26), te kirikiri karihi (10), te kirikiri karihi (9), me nga pores karihi (5).Ko enei pūmua karihi-a-rohe e 80% o nga pūmua whakarangatira, e whakaatu ana i te motuhake o te PDPL (Taupiri Pikitia 8a-d).
I te whakatau i te kaha o te PDPL ki te mahi tohu tata i roto i nga okana, ka whakamatauhia mena ka taea te whakamahi a PDPL ki te tātari i nga hoa here POI.Ina koa, i whai maatau ki te whakamaarama i te tātaritanga PDPL o nga pūmua cytosolic, e kiia ana he tino uaua ake i o raatau taangata-a-rohe na te mea he tino hihiri.Ko te bromodomain me te extraterminal (BET) pūmua BRD4 kua aro mai ki a maatau mo tana mahi nui ki nga momo mate 35, 36.Ko te matatini i hangaia e te BRD4 he coactivator transcriptional me tetahi whaainga rongoa nui.Na roto i te whakahaere i nga korero o te c-myc me te Wnt5a o nga waahanga tuhi, ko te BRD4 te whakaaro ko te tino whakatau mo te mate pukupuku myeloid (AML), te myeloma maha, te lymphoma o Burkitt, te mate pukupuku koroni me nga mate inflammatory37,38.I tua atu, ko etahi o nga huaketo e kii ana ki te BRD4 ki te whakahaere i nga tuhinga huaketo me te waea pūkoro, penei i te papillomavirus, HIV, me te SARS-CoV-236,39.
Hei mahere i te taunekeneke BRD4 ma te whakamahi i te PDPL, i whakakotahihia e matou te miniSOG me te N-, C-terminal isoform poto ranei o BRD4.Ko nga hua o te Proteomic i whakaatu i te nui o te inaki i waenga i nga hanganga e rua (Taupiri Fig. 9a).Ko te proteome karihi kua tautuhia me te miniSOG-H2B e hipoki ana i te 77.6% o nga pūmua e taunekeneke ana ki te BRD4 (Taupiri Fig. 9b).Na, ko nga wa rereke o te whakamarama (2, 5, 10, 20 min) i whakamahia hei whakatika i te radius tohu (Fig. 4a me nga raraunga taapiri 3).Ka whakatauhia e matou i nga wa poto ake, ka tapaina e te PDPL nga hoa hono tika, engari ko nga waa roa ka uru ki nga pūmua i kitea i roto i nga wa poto mo te whakahoahoahoahoa me nga whaainga autaki i roto i nga papanga tapanga.Ko te mea pono, i kitea e matou he kaha i waenga i nga waahi tata (84.6% mo te 2 me te 5 min; 87.7% mo te 5 me te 10 min; 98.7% mo te 10 me te 20 min) (Fig. 4b me te Tāpiri 9c).I roto i nga roopu whakamatautau katoa, ehara i te mea ko te tapanga whaiaro BRD4 anake, engari he maha nga whaainga e mohiotia ana penei i te MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, me te HMGB1 kua tuhia ki roto i te papaa raraunga aho.Ko te kaha o te katote o enei whaainga he rite ki te wa whakamaarama (Whakaahua 4c me te Whakaaturanga 9d taapiri).Ko te tātaritanga GO o nga pūmua i tautuhia i roto i te roopu 2-meneti i whakaatu ko nga pūmua kua tautuhia he waahi i roto i te karihi me te whai waahi ki te whakahou i te chromatin me te mahi RNA polymerase.Ko te mahi irapoi o te pūmua i whakarangatirahia i roto i te chromatin here, transcriptional coactivation ranei, e rite ana ki te mahi BRD4 (Fig. 4d).Ko te tātaritanga taunekeneke pūmua kua whakahoahohia e te paparangi raraunga i whakaatu i te taumata tuatahi o nga taunekeneke autaki i waenga i te BRD4 me te whanau HDAC nga matatini taunekeneke penei i te SIN3A, NCOR2, BCOR, me te SAP130 (Fig. 4e and Supplementary Fig. 9e), e rite ana ki te BRD4 me te HDAC here acetylated histones ..I tua atu, ko nga whaainga kanohi i tohua e LC-MS/MS, tae atu ki te Sin3A, NSUN2, Fus, me te SFPQ, i whakapumauhia e te uru o te Hauauru (Fig. 4f).Ina tata nei, kua korerohia te ahua o te BRD4 poto ki te hanga karihi me nga waahanga wehenga wai-wai (LLPS).Ko nga pūmua here RNA Fus me te SFPQ ka takawaenga i te LLPS o nga momo momo tukanga pūkoro, a kua tohua i konei he pūmua here BRD4 kaore i tuhia.Ko te taunekeneke i waenga i te BRD4 me te SFPQ i whakapumautia e nga whakamatautau co-immunoprecipitation (co-IP) (Whakaahua 4g), e kii ana i tetahi atu tikanga mo te wehenga o te wahanga wai-wai-wai-wai-wai-wai-waahanga a BRD4 e tika ana kia tirotirohia ano.Ka huihuia, ko enei hua e kii ana ko te PDPL he papaa pai mo te tautuhi i nga hononga BRD4 e mohiotia ana me nga pūmua here kore mohiotia.
he tohu Mahinga mo te tohu tata BRD4-whakawaenga-miniSOG, nga wa whakaatu: 2, 5, 10, me te 20 min.b Inaki o nga pūmua i tautuhia i nga waa whakamarama rereke.Ko te whakarangatira pūmua i kitea i roto i te HEK293T-miniSOG-BRD4 he tino nui ki te whakataurite ki te HEK293T momo mohoao.c Te kaha o te katote i te ine i te maangai kore tapanga e mohiotia ana nga pūmua here BRD4 i roto i te wa whakakitenga kua tohua.n = 3 tauira motuhake koiora.Ko nga raraunga e whakaatuhia ana ko te toharite ± inenga paerewa.d Te tātari ira ontological (GO) o nga pūmua kua tautuhia i roto i te roopu 2-meneti.Ko nga kupu tuatahi tekau GO kua whakarārangihia.Ka tae nga mirumiru kia rite ki te waahanga kupu GO, me te rahi o te mirumiru he rite ki te maha o nga pūmua e kitea ana i ia wahanga.e Te tātari aho o nga pūmua e taunekeneke ana me te BRD4.Ko nga porowhita kōwhai he kāpia tika, ā, ko ngā porowhita hina te paparanga tuatahi o te kāpia autaki.Ko nga raina whero e tohu ana i nga tauwhitinga kua whakatauhia e te whakamatautau, ko nga raina kikorangi e tohu ana mo nga taunekeneke kua tohuhia.f Ko nga tohu herenga BRD4 i kitea i roto i te LC-MS/MS i manatokohia e te whakakorenga o te Tai Hauauru.g Ko nga whakamatautau co-immunoprecipitation e whakau ana i te taunekeneke i waenga i te SFPQ me te BRD4.Ko enei whakamatautau i tukuna takitahi i te iti rawa kia rua me nga hua rite.Ka whakaratohia nga raraunga mata ki te ahua o nga konae raraunga mata.
I tua atu i te tautuhi i nga whaainga e pa ana ki te POI kaore i rehitatia, e whakapae ana matou ka pai te PDPL mo te tautuhi i nga taputapu mo nga enzymes, me kii te tohu o nga pūmua here autaki i roto i nga matatini nui hei tohu i nga taputapu kore rehita.Ko Parkin (kua whakawaeheretia e PARK2) he hononga E3, a, e mohiotia ana ko nga huringa i roto i te parkin ka puta te mate o te rangatahi autosomal recessive Parkinson's (AR-JP)42.I tua atu, kua whakaahuahia te parkin he mea nui mo te mitophagy (mitochondrial autophagy) me te tango i nga momo hāora urupare.Heoi ano, ahakoa he maha nga taputapu parkin kua tohua, kei te noho marama tonu te mahi a te parkin ki tenei mate.Hei whakamohio i ona taputapu kore tohu, i whakamatauria te PDPL ma te taapiri i te miniSOG ki te N-, C-mutu ranei o te parkin.I tukinotia nga pūtau ki te kaikawe iraoho waro-cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) hei whakahohe i te parkin ma te ara PINK1-Parkin.Ka whakatauritea ki a maatau hua BRD4 PDPL, ko te whakakotahitanga o te parkin N-terminus i whakaatuhia he huinga nui ake o nga pūmua whaainga, ahakoa he nui ake te waahanga o te C-terminus (177 mai i te 210) (Whakaahua 5a,b me te Raraunga Tāpiri 4).he rite tonu te hua ki nga purongo ka taea e nga tohu tohu-N te whakahohe a Parkin44.He mea whakamiharo, he 18 noa iho nga pūmua inaki i roto i o maatau raraunga me nga hua AP-MS kua whakaputaina mo Parkin43, tera pea na nga rereketanga i waenga i nga raina pūtau me nga rerenga mahi proteomics.I tua atu i nga pūmua e wha e mohiotia ana (ARDM1, HSPA8, PSMD14, me PSMC3) kua tautuhia e nga tikanga e rua (Fig. 5c)43.Hei whakamana ake i nga hua o te LC-MS / MS, ka whakamahia te maimoatanga PDPL me te whakakorenga o te Tai Hauauru o muri mai hei whakataurite i nga hua o te HEK293T parent cell assay and the stable N-terminal parkin line.Ko nga whaainga kaore i mohiotia i mua i te CDK2, DUT, CTBP1, me te PSMC4 i whakamatauhia me te herenga mohio, DNAJB1 (Fig. 5d).
Ko te puia puia o nga pūmua tauwhitiwhiti-parkin i roto i nga pūtau HEK293T me te miniSOG e tino kitea ana kua honoa ki te N-, C-mutu ranei o parkin (n = 3 nga whakamatautau koiora motuhake).I whakamahia te whakamātautau-t a te tauira-rua ki runga i nga papa puia.I whakamahia a HEK293T hei mana kino. Ko nga pūmua kua tino rerekee kua tohua ki te whero (p <0.05 me >2-fold te rereketanga o te kaha o te katote). Ko nga pūmua kua tino rerekee kua tohua ki te whero (p <0.05 me >2-fold te rereketanga o te kaha o te katote). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). Ko nga pūmua tino rerekee kua tohua ki te whero (p <0.05 me > 2-fold te rereketanga o te kaha o te katote).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05 和> 2 倍离子强度差异）。显着变化的蛋白质以红色突出显示（p < 0.05和> 2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). Ko nga pūmua tino rerekee kua tohua ki te whero (p <0.05 me > 2-whakarereketanga o te kaha katote).Ko nga pūmua e pa ana he mea nui mo HEK293T-miniSOG engari ehara i te mea nui mo HEK293T ka whakaatuhia ki te matomato.b Hoahoa Venn e whakaatu ana i nga pūmua inaki i waenga i nga hanga-waewae-N me te hanga-waa-C.Ka taea e nga tohu tohu-N te whakakorikori i te parkin me te hua ka nui ake te mohio ki nga pūmua.c Te hoahoa Venn e whakaatu ana i nga pūmua inaki i waenga i te PDPL me te AP-MS.Kua whakarārangihia te hunga pāhekoheko rongonui, tae atu ki te 4 o te 18 nga pūmua inaki me te 11 o te 159 nga pūmua kua tohua ki te PDPL.d Ko nga whainga mangai i tohua e LC-MS/MS i manatokohia e te whakakorenga o te Tai Hauauru.Ko te Ssu72 me te SNW1 i tohuhia he taputapu parkin kore rehita.Ko enei plasmids pūmua e tohuhia ana e te FLAG i whakawhitia ki HEK293T me HEK293T-Parkin-miniSOG whai muri i te maimoatanga CCCP i nga waahi rereke.I kaha ake te paheketanga i roto i te raina korero nui a Parkin.f Ma te whakamahi i te aukati proteasome MG132, i whakapumautia ko te tukanga whakahekenga o Ssu72 me SNW1 kei te takawaenga e te proteasome-ubiquitination.Ko enei whakamatautau i tukuna takitahi i te iti rawa kia rua me nga hua rite.Ka whakaratohia nga raraunga mata ki te ahua o nga konae raraunga mata.
Otirā, ko ngā pūmua kua tohua e te PDPL me whakauru i ngā pūmua here-parkin me o ratou taputapu.Ki te kite i nga taputapu parkin kaore i rehitatia, i tohua e matou e whitu nga pūmua kua tautuhia (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 me SNW1) me nga plasmids whakawhiti ki te whakaatu i enei ira ki te HEK293T noa me te whakaatu pono i te miniSOG-Parkin's HEK293T maimoatanga whai muri i te CCCP.Ko nga taumata o nga pūmua Ssu72 me SNW1 i tino whakahekehia i roto i te raina miniSOG-Parkin pumau (Fig. 5e).Ko te maimoatanga me te CCCP mo nga haora 12 i puta te tino paheketanga o nga taputapu e rua.Ki te tirotiro mehemea kei te whakahaerehia te whakahekenga o Ssu72 me te SNW1 e te proteasome-ubiquitination, i tapirihia te kaitautoko proteasome MG132 ki te aukati i te mahi proteasome, a, i te mea ka kitea e matou kua whakakorehia to ratou tukanga whakaheke (Fig. 5f).I whakapumauhia etahi atu whaainga kore-waahi hei kaikorero a Parkin ma te whakamahi i te taarua o te Tai Hauauru (Taupiri Whakaatu 10), e whakaatu ana i nga hua rite ki te LC-MS / MS.Hei mutunga, ko te whakaurunga o te rerenga mahi PDPL me te whakamohiotanga whakawhiti pūmua whainga ka taea te tautuhi i nga taputapu ligase E3 kaore i rehitatia.
Kua whakawhanakehia e matou he papa tohu tohu tata e taea ai e koe te tautuhi i te waahi me te wa e pa ana ki nga POI.Ko te turanga i runga i te miniSOG photosensitizer pūmua, e tata ana ki te 12 kDa, iti iho i te haurua o te rahi o te enzyme APEX2 pakeke (27 kDa) me te kotahi tuatoru te rahi o TurboID (35 kDa).Ko te rahi iti me tino whakawhänuihia te awhe o nga tono mo te ako i nga taunekeneke pūmua iti.Ko te torotoro atu ki etahi atu whakamaarama whakaahua, ahakoa he pūmua kua whakawaeherehia e te ira, he ngota ngota iti ranei, hei whakanui ake i te tukunga o te hāora kotahi me te whakawhänui i te tairongo o tenei huarahi.Mo te putanga o naianei o te miniSOG, ka taea te whakatutuki i te taumira teitei ma te whakamarama kikorangi hei whakahohe i nga tohu tata.I tua atu, ko te roa o te waahi ka tukuna he "kapua" nui o te hāora singlet, na te whakarereketanga o nga toenga o te histidine tawhiti, te whakanui ake i te radius tapanga, me te kaha ki te whakatika i te whakataunga mokowā PDPL.I whakamatauria ano e matou nga rangahau matū e whitu hei whakanui ake i te ōwehenga tohu-ki-papamuri me te tirotiro i te tikanga ngota i muri i tenei huarahi.Ko te rerengamahi TOP-ABPP i honoa me te rapunga tuwhera kore i whakapumau i puta nga whakarereketanga anake i roto i nga histidines a kaore he taiao moroiti rite tonu i kitea mo te nui ake o nga whakarereketanga histidine, engari mo te hiahia ngawari mo nga histidines i roto i te rohe porowhita.
I whakamahia ano te PDPL ki te tohu i nga poroteima subcellular me te motuhake o te proteome me te kapi i te iti rawa ki te rite ki etahi atu tapanga tata me nga tikanga rangahau matū-a-okana.Kua pai hoki te whakamahi i nga tohu tata ki te tohu i te mata, te lysosomal, me nga proteome-hononga huna46,47.E whakapono ana matou ka hototahi te PDPL ki enei okana-a-roto.I tua atu, i whakawerohia e matou te PDPL ma te tautuhi i nga whaainga mo te herea o te pūmua cytosolic he uaua ake i nga pūmua herea o te membrane na runga i o raatau ahuatanga hihiri me te whakauru ki roto i nga whakawhitiwhitinga waahi.I whakamahia te PDPL ki nga pūmua e rua, te coactivator transcriptional BRD4 me te ligase E3 Parkin e pa ana ki te mate.Ko enei pūmua e rua i whiriwhiria ehara i te mea mo o raatau mahi koiora taketake, engari mo o raatau whainga haumanu me te kaha whakaora.Mo enei POI e rua, i kitea nga hoa hono rongonui me nga whaainga kaore ano kia rehitatia.Ko te mea nui, ko te SFPQ te pūmua e hono ana ki te wehenga-waahanga i whakapumautia e te co-IP, tera pea e tohu he tikanga hou na BRD4 (poto poto) te whakahaere i te LLPS.I te wa ano, e whakapono ana matou ko te tautuhi i nga taputapu Parkin he ahuatanga e hiahiatia ana te tautuhi i nga taapiri kore.I tautuhia e matou e rua nga taputapu parkin kaore i mohiotia, ka whakapumauhia to ratau paheketanga i te taha o te ara ubiquitination-proteasome.Ina tata nei, kua hangaia he rautaki hopu-a-ringa ki te kimi i nga substrate hydrolase ma te mahanga i a raatau ki nga enzymes.Ahakoa he tikanga tino kaha tenei, kaore e pai mo te tātari i nga taputapu e uru ana ki te hanganga o nga matatini nui me te hiahia ki te hanga i nga here kovalent i waenga i te enzyme me te taputapu.Kei te tumanako matou ka taea te whakawhānui atu i te PDPL ki te ako i etahi atu huinga pūmua me nga hapu o te enzyme, penei i nga hapu deubiquitinase me te metalloprotease.
He ahua hou o te miniSOG, e kiia nei ko SOPP3, kua whakawhanakehia me te pai ake o te hanga o te hāora kotahi.I whakatauritea e matou te miniSOG me te SOPP3 ka kitea he pai ake te mahi tohu, ahakoa i noho tonu te owehenga tohu-ki-haruru (Taupiri Fig. 11).I whakapae matou ko te arotautanga o te SOPP3 (hei tauira, na roto i te kukuwhatanga whakahau) ka nui ake te pai o nga pūmua photosensitizer me poto ake te wa marama, na reira ka kaha ake te hopu i nga tukanga pūkoro.Ko te mea nui, ko te putanga o naianei o te PDPL he iti noa ki te taiao pūkoro na te mea e hiahia ana kia marama te marama kikorangi, kaore e taea te uru ki roto i nga kopa hohonu.Ko tenei ahuatanga ka aukati i te whakamahi i nga rangahau tauira kararehe.Heoi, ko te whakakotahitanga o te optogenetics me te PDPL ka whai waahi mo te rangahau kararehe, ina koa i roto i te roro.I tua atu, ka tangohia ano e etahi atu kaiwhakaahua whakaahua infrared i tenei herenga.Kei te haere tonu te rangahau mo tenei wahanga.
Ko te raina pūtau HEK293T i whiwhi mai i te ATCC (CRL-3216).Ko te raina pūtau i whakamatauhia he kino mo te mate mycoplasma me te whakatipu i roto i te DMEM (Thermo, #C11995500BT) kua taapirihia ki te 10% serum bovine fetal (FBS, Vistech, #SE100-B) me te 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV30010).tupu i roto.
3-Aminophenylene (tauira 3) me (4-ethynylphenyl)methanamine (tauira 4) i hokona mai i Bidepharm.Propylamine (probe 2) i hokona mai i Energy-chemicals.N-(2-Aminophenyl)pent-4-ynamide (probe 1) i whakahiatohia kia rite ki nga tikanga whakaputa.
Ko te Ripanga Tāpiri 1 e whakarārangi ana i ngā hangahanga ira i whakamahia i tēnei rangahau.Ko nga raupapa miniSOG me te KillerRed i kii mai i te plasmid koha mai i P. Zou (Te Whare Wananga o Peking).I ahu mai te raupapa whakangao mitochondrial matrix i te 23 N-terminal amino acids o COX4 me te kati ki nga vectors kua tohua ma te whakamahi i te huihuinga Gibson (Beyotime, #D7010S).Ki te aro ki te membrane me te karihi o te reticulum endoplasmic, SEC61B DNA tangata (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) kua whakanuia e PCR mai i te whare pukapuka cDNA o nga pūtau HEK293T, me te H2B DNA (na D. Lin, Shenzhen Bay Laboratory) me te kapohia, pera me te korero i runga ake nei.Ki te kore e tohuhia, ko etahi atu ira pūmua e whakamahia ana mo te whakawhiti me te hanga i nga raina pūtau pumau i whakakahahia te PCR mai i te whare pukapuka cDNA pūtau HEK293T.I whakamahia te G3S (GGGS) me te G4S (GGGGS) hei hononga i waenga i te pūmua maunu me te miniSOG.He tohu epitope V5 (GKPIPNPLLGLDST) i taapirihia ki enei hanga hanumi.Mo te whakahuatanga i roto i nga whakangote me te whakatu i tetahi raina pūtau pumau, ka tukuna te hanga whakakotahitanga miniSOG ki te pLX304 lentiviral vector.Mo te whakaputanga huakita, ka katihia te miniSOG ki te vector pET21a kua tapaina ko 6xHis i te C-terminus.
I ruia nga pūtau HEK293T ki te 2.0 x 105 pūtau mo ia puna i roto i nga pereti ono-puna, ka whakawhitia i te 24 haora i muri mai me te recombinant lentiviral plasmids (2.4 μg pLX304) me te plasmids tākai viral (1.5 μg psPAX2 me te 1.2 μg pMD2.G0) me te whakamahi i te Lipoyotime. , #C0533), mo te 80% te hanumi.Whai muri i te whakawhitinga mo te po, ka hurihia te reo ka whakakororia mo etahi atu haora 24.Ko te kohinga o te huaketo i mahia i muri i te 24, 48 me te 72 haora.I mua i te mate o nga raina pūtau kua tohua, ka tohua te reo viral i roto i te tātari 0.8 μm (Merck, #millex-GP) me te polybrene (Solarbio, #H8761) i whakauruhia ki te kukū o te 8 μg / ml.I muri i nga haora 24, ka tukuna nga ruma kia ora ma te huri i te reo.I tohua nga pūtau ma te whakamahi i te 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) mo nga waahanga tuatahi e toru hei kowhiringa iti ake.Na ka whakamahia te 20 μg/ml hei tikanga tino kaha mo nga waahanga e toru e whai ake nei.
I ruia nga pūtau ki roto i nga ruma 12-puna (Ibidi, #81201) i te kiato tata ki te 20,000 nga pūtau mo ia puna.Hei whakapai ake i te whakapiringa o nga pūtau HEK293T, tāpirihia te 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) kua waimeha ki roto i te phosphate buffered saline (PBS, Sangon, #B640435) i te 37°C.Ko nga ruuma i mua mo te 1 haora ka tangohia ki te PBS.I muri i te 24 haora, ka horoia nga pūtau kotahi ki te PBS, ka werohia ki te 1 mM probe 3 i roto i te wairewa tote taurite hou a Hanks (HBSS, Gibco, #14025092) mo te 1 haora i te 37°C, katahi ka werohia ki te rama puru (460 nm). ).) i whakamahana mo te 10 meneti i te pāmahana rūma.I muri i tera, ka horoia nga ruma e rua ki te PBS me te 4% formaldehyde i roto i te PBS (Sangon, #E672002) mo nga meneti 15 i te pāmahana rūma.Ko te taikaha o te formaldehyde i tangohia mai i nga pūtau mau ma te horoi e toru nga wa ki te PBS.Ko nga pūtau ka uru ki te 0.5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) i roto i te PBS me te horoi i nga wa 3 ki te PBS.Na ka tango i te ruma ka tapiri atu ki ia tauira 25 µl o te ranunga tauhohenga pawhiri kei roto 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) me te 0.5 mg / ml konutai ascorbate (Aladdin, no. S105024) ka whakakororia mo te 30 meneti i te pāmahana rūma.Whai muri i te tauhohenga mahanga, ka horoia nga pūtau e ono nga wa ki te PBS kei roto te 0.05% Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ka aukatihia ki te 5% BSA (Abcone, #B24726) i roto i te PBST mo te 30 meneti i te pāmahana rūma.
Mo te immunostaining colocalization, i incubated nga pūtau ki nga antibodies tuatahi i runga i nga tikanga kua tohua: kiore anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), rapeti anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), rapeti polyclonal anti-calnexin antibody (1:500, Abcam, #ab22595) rapeti anti-lamin A/C monoclonal antibody (1:500; CST, #2032) i te 4 °C i te po.I muri i te horoinga e 3 nga wa ki te PBST, ka werohia nga pūtau ki nga antibodies tuarua: koati anti-rabbit Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluted 1:1000, koati anti-kiore Alexa Fluor 594 (CST, #8889) diluted 1:1000.waimeha Waimeha ki te pāmahana rūma mo te 30 meneti.Ka horoia nga pūtau e 3 nga wa ki te PBST me te taatai ​​​​ki te DAPI (Thermo, #D1306) i roto i te PBS mo te 10 meneti i te pāmahana rūma.I muri i nga horoinga e 3 me te PBS, ka hiri nga pūtau ki te 50% glycerol (Sangon, #A600232) i roto i te PBS mo te whakaahua.I tikina nga whakaahua Immunofluorescent ma te whakamahi i te ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope me te rorohiko ZNE 3.5.
Mo te atahanga karekorero hāora kotahi, ka horoi rua nga pūtau ki te parepare Hanks HEPES i mua i te taapiri i te 100 nM Si-DMA ki roto i te parapara HEPES Hanks (DOJINDO, #MT05).I muri i te whakamohiotanga ki te marama, ka whakauruhia nga ruma ki roto i te incubator CO2 i te 37 ° C mo te 45 meneti.Ka rua nga wa i horoia nga pūtau ki te parepare HEPES a Hanks, ka pania ki te Hoechst i roto i te parepare HEPES a Hanks mo te 10 meneti i te pāmahana rūma me te whakaata ma te whakamahi i te miihini ZEISS LSM 900 confocal microscope., #M36008) i roto i te HBSS buffer kei roto te konupora me te konupora.I muri i te waahi ki te marama, ki te doxorubicin ranei (MCE, #HY-15142A), ka whakauruhia nga ruma ki roto i te incubator CO2 i te 37 ° C. mo nga meneti 10, ka horoia e rua ki te HBSS buffer, ka whakauruhia ki te Hoechst i roto i te HBSS buffer i te pāmahana rūma.meneti.I whakamahia te Doxorubicin hei mana tirotiro pai i reira ka rongoa nga pūtau ki te 20 μM doxorubicin i roto i te HBSS kei roto 1% BSA mo te 30 meneti.I tikina nga whakaahua Immunofluorescent ma te whakamahi i te Zeiss LSM 900 confocal microscope.
Ko nga pūtau HEK293T e whakaatu mau ana i te mito-miniSOG i ruia ki te kiato o te 30% i roto i nga riu 15 cm.I muri i nga haora 48, ka tae atu ki te 80% te whakakotahitanga, ka horoia nga ruma kotahi ki te PBS, ka werohia ki te 1 mM Probe 3 i roto i te HBSS hou mo te 1 haora i te 37 ° C ka whakamarama ki te rama puru mo te 10 meneti i te ruma. pāmahana..I muri mai, ka rua nga wa horoi i nga ruma ki te PBS, ka waruhia, ka whakairihia ano ki roto i te tio-makariri PBS buffer kei roto nga aukati protease kore-EDTA (MCE, #HY-K0011).I lysed nga pūtau na roto i te sonicating te pito mo te 1 meneti (1 hēkona i runga me te 1 hēkona atu i te 35% tiwerawera).Ko te ranunga hua i centrifuged i te 15,871 xg mo te 10 min i te 4 ° C ki te tango i nga otaota, a ka whakatikahia te kohinga supernatant ki te 4 mg / mL ma te whakamahi i te kete BCA protein assay kit (Beyotime, #P0009).Whakakotahitia te 1 ml o te lysate i runga ake nei me te 0.1 mM biotin azide ka taea te whakaahua (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437), me te 1 mM CuSO4 incubator ki raro. hurihuri mo te 1 haora i te pāmahana rūma.Whai muri i te tauhohenga mokowhiti, tāpirihia te ranunga ki te wairewa whakauru-mua (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) i roto i te ipu karaihe 10 ml.Ko nga tauira i konatunatuahia me te centrifuge i te 4500 g mo te 10 meneti i te pāmahana rūma.Ko nga wairewa o raro me o runga ka makahia, ka horoi rua te parapara ki te 1 ml o te methanol me te centrifuge i te 15871xg mo te 5 min i te 4°C.Tāpirihia te 1 ml o te 8 M urea (Aladdin, no. U111902) ki te 25 mM ammonium bicarbonate (ABC, Aladdin, no. A110539) hei whakakore i te rerenga.I whakauruhia nga tauira ki te 10 mM dithiothreitol (Sangon, #A100281 i te 25 mM ABC) mo nga meneti 40 i te 55 ° C ka whai i te taapiri o te 15 mM iodoacetamide hou (Sangon, #A600539) i te mahana o te ruma i roto i te pouri.Alkylation i roto i te 30 meneti..I taapirihia he 5 mM dithiothreitol hei aukati i te hohenga.Whakaritea te 100 µl NeutrAvidin agarose (Thermo, #29202) mo ia tauira ma te horoi kia toru nga wa ki te 1 ml PBS.Ko te otinga proteome i runga ake nei i waimeha ki te 5 ml PBS me te incubated ki mua-horoia NeutrAvidin agarose pirepire mō te 4 haora i te pāmahana rūma.Ka horoia nga pirepire 3 wa ki te 5 ml PBS kei roto 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 wa ki te 5 ml PBS kei roto 1M urea, me te 3 wa ki te 5 ml ddH2O.Ko nga pirepire ka kohia e te centrifugation me te resuspended i roto i te 200 μl o 25 mM ABC kei roto 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) me te 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).Whakamātauria te pō i te 37°C me te hurihanga.I whakamutua te tauhohenga ma te taapiri i te waikawa formic (Thermo, # A117-50) kia tae ra ano te pH ki te 2-3.I horoia nga pirepire 3 nga wa me te 1 ml o te PBS kei roto 0.2% SDS, 3 nga wa me te 1 ml o te PBS kei roto te 1 M urea, a ka 3 nga wa me te 1 ml o te wai makuku.Ko nga peptides kua whakarereketia i tukuna e te lysis marama (365 nm) mo te 90 min ma te whakamahi i te 200 μl o 70% MeOH.I muri i te centrifugation, ka kohia te supernatant.Ka horoia nga pirepire kotahi ki te 100 μl o te 70% MeOH ka whakahiatohia nga supernatants.I whakamarokehia nga tauira ki roto i te whakamaroke hiko o Speedvac ka rongoa ki te -20°C tae noa ki te tātari.
Hei tautuhi me te tatau i nga peptides kua whakarerekehia te hāora kotahi, ka wetewete ano nga tauira ki te 0.1% waikawa formic me te 1 μg o nga peptides i tātarihia ma te whakamahi i te Orbitrap Fusion Lumos Tribrid papatipu spectrometer me te puna ESI nano mai i Tune me Xcalibur mai i te rorohiko kaihoko 4.3.I wehea nga tauira i runga i te 75 µm × 15 cm te kapi i roto i te pou kapi me te 3 µm C18 rauemi (ReproSil-pur, #r13.b9.) ka hono atu ki te punaha EASY-nLC 1200 UHPLC (Thermo).I wehea nga peptides e te chromatography rōnaki 95 meneti mai i te 8% te whakarewa B ki te 50% te whakarewa B (A = 0.1% te waikawa formic i roto i te wai, B = 0.1% te waikawa formic i roto i te 80% acetonitrile), ka piki ake ki te 98% B min. i roto i te 6 min i te tere rere o te 300 nl / min.Ko te Orbitrap Fusion Lumos he kohi raraunga i waenga i te katoa o te MS scan me te MS2 scan i runga i nga raraunga.I whakatauhia te ngaohiko pupuhi ki te 2.1 kV me te pāmahana o te katote kawe capillary he 320°C.MS spectra (350-2000 m/z) i kohia me te taumira o 120,000, AGC 4 × 105, me te wa whakauru morahi o 150 ms.Ko te 10 te nuinga o nga mea whakarea ka tukuna i roto i ia karapa katoa i wehewehea ma te whakamahi i te HCD me te kaha tukinga o te 30%, he matapihi wehe tapawha o te 1.6 m/z, me te tautuhinga taumira o te 30,000.He whainga AGC mo te matakite papatipu tandem ma te whakamahi i te 5×104 me te wa whakauru morahi 150 ms.Kua whakaritea te wehenga hihiri ki te 30 hēkona. Ko nga katote kaore i tautapahia, ko te hunga ranei he utu 1+ me >7+ i paopaohia mo MS/MS. Ko nga katote kaore i tautapahia, ko te hunga ranei he utu 1+ me >7+ i paopaohia mo MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ko nga katote katote, katote ranei me te utu o te 1+ me te >7+ i paopaohia mo MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ko nga katote, nga katote ranei me nga utu o te 1+ me te >7+ i paopaohia mo MS/MS.
Ka tukatukahia nga raraunga mata ma te whakamahi i te papanga rorohiko FragPipe i runga i MSFragger.I whakatauhia nga whakahiato papatipu me nga waikawa amino e rite ana ma te whakamahi i te algorithm rapu tuwhera me te tuunga o mua o te -150 ki te 500 Da.Ko nga peptides kua whakarerekehia ka tohua ma te whakamahi i nga whakarereketanga histidine me nga hua papatipu o +229.0964 me +247.1069 Da i roto i te PD (Proteome Discoverer 2.5, Thermo).
Ko nga pūtau e whakaatu ana i te ira miniSOG kua whakakikoruatia i whakakikoruatia ki nga riu 6 cm.I te taenga ki te ~80% te whakakotahitanga, ka horoia nga pūtau kotahi ki te HBSS (Gibco, #14025092), ka whakakororiahia ki nga rangahau matū i roto i te HBSS mo te 1 haora i te 37°C ka whakamarama ki te rama kikorangi.10W LED mo te 20 meneti i te pāmahana rūma.Hei whakatau ko tehea momo momo hāora tauhohe e uru ana ki te PDPL, 0.5 mM huaora C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 mM mannitol (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 i tāpirihia ki ngā pūtau hei tāpiritanga.I muri i te horoinga me te PBS makariri, ka werohia nga pūtau, ka kohia i roto i te 1.5 ml centrifuge ngongo, ka sonicated ki te pito mo te 1 min i roto i te 200 μl o PBS me te 1x protease inhibitor me te kore EDTA (1 s me te 1 s kahore, amplitude 35%).Ko te ranunga hua i centrifuged i 15,871 × g mo te 10 min i te 4 °C me te kukū supernatant i whakaritea ki te 1 mg / mL te whakamahi i te kete BCA protein assay kit.Ko te ahua o te 50 µl o te lysate i runga ake nei i whakakorohia ki te 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, me te 1 mM CuSO4 mo te 1 haora i te pāmahana rūma me te hurihanga mai i raro ki runga.I muri i te tauhohenga patene, ka mahia te rerenga me te acetone ma te taapiri i te 250 μl o te acetone i mua i te makariri ki nga tauira, ka whakamakuku i te -20°C mo te 20 min me te centrifuging i te 6010xg mo te 10 min i te 4°C.Kohia te pire ka kohuatia ki te 50 µl o te 1x te parepare a Laemmli mo te 10 meneti i te 95 °C.Ka wetewetehia nga tauira i runga i nga reera roa SDS-PAGE me te whakaata ma te whakamahi i te punaha whakaahua Bio-rad ChemiDoc MP Touch me te rorohiko Image Lab Touch.
Ko te whakapuaki me te purenga o te recombinant miniSOG-6xHis i mahia pera i te korero i mua.I te wa poto, ko nga pūtau E. coli BL21(DE3) (TransGen, # CD701-02) i hurihia ki te pET21a-miniSOG-6xHis me te whakaputanga pūmua me te 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).I muri i te lysis pūtau, ka purea nga pūmua ma te whakamahi i nga pirepire Ni-NTA agarose (MCE, no. 70666), ka whakahekehia ki te PBS, ka rongoa ki te -80 ° C.
Mo te whakamatautau tata tapanga in vitro, uruhia te 100 μM miniSOG kua purea, 1 mM probe 3, me te 1 μg anti-label kiore monoclonal antibody (TransGen, #HT501-01) i roto i te PBS ki te nui o te 50 μl..Ko te ranunga tauhohenga i rarihia ki te rama puru puru mo te 0, 2, 5, 10, me te 20 meneti i te pāmahana rūma.Ko te ranunga i whakakororiahia ki te 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligand, me te 1 mM CuSO4 mo te 1 h i te pāmahana rūma i runga i te wiriwiri nekehanga whakarunga.Whai muri i te tauhohenga mokowhiti, whakauruhia kia 4x te parepare a Laemmli ki te ranunga ka kohuatia i te 95°C mo te 10 meneti.I wetewetehia nga tauira i runga i nga karaehe SDS-PAGE ka tātarihia e te hauauru blotting me te streptavidin-HRP (1:1000, Solarbio, #SE068).
I whakamahia he peptide synthetic e mau ana ki te histidine me te C-terminal amidation (LHDALDAK-CONH2) hei tātari i te tapanga in vitro e tata ana ki te peptide.I roto i tenei whakamatautau, 100 μM miniSOG kua purea, 10 mM probe 3 me 2 μg/ml peptide synthetic i konatunatua ki te PBS i roto i te tapeke o te rōrahi tauhohenga o te 50 μl.Ko te ranunga tauhohenga i rarihia ki te rama puru puru mo te 1 haora i te pāmahana rūma.Kotahi microliter o te tauira i wetewetehia ma te whakamahi i te punaha LC-MS (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight spectrometer papatipu me te punaha tātari hihinga MassLynx).
Ko nga pūtau HEK293T e whakaatu mau ana i te ira whakakotahitanga miniSOG i ruia ki roto i nga riu 10 cm mo nga raina he rereke nga momo okana (Mito, ER, Nucleus) me nga rihi 15 cm mo nga raina Parkin-miniSOG me BRD4-miniSOG.I te taenga ki te ~90% te whakakotahitanga, ka horoia nga ruma kotahi ki te HBSS, katahi ka whakakororiahia ki te tirotiro 3 i roto i te HBSS mo te 1 haora i te 37°C ka whakamaramahia ki te 10 W puru LED i te pāmahana rūma.Mo te tapanga kore-paanga o Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanide kawe m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) me te rangahau 3 i roto i te HBSS i taapirihia mo te 1 haora i te 37°C.Ko te lysis pūtau, te matū pawhiri, te whakaheke me te takahanga alkylation he rite tonu ki te korero i runga ake nei, haunga te 2 mg o te lysate i tapirihia me te biotin PEG3 azide i whakamahia i roto i te tauhohenga patene hei utu mo te biotin azide ka taea te whakaahua.I muri i te whakarangatira, ka horoia nga pirepire 3 nga wa me te 5 ml o te PBS kei roto 0.2% SDS, 3 nga wa me te 5 ml o te PBS kei roto i te 1 M urea, me te 3 nga wa me te 5 ml o te PBS.I muri mai, ka tapirihia te 2 µg trypsin ki te 300 µl 25 mM ABC kei roto 1 M urea ki te wehe i te pūmua i te po i te 37°C.I whakamutua te tauhohenga ma te taapiri i te waikawa formic kia tae ra ano ki te pH 2-3.I muri i te trypsinization i runga i nga pirepire, ka whakakorehia te wairewa peptide ma te whakamahi i te pou SOLAµ HRP (Thermo, #60209-001) ka whakamarokehia i roto i te whakakorikori korehau Speedvac.I wetewetehia nga Peptides i roto i te 0.1% te waikawa formic me te 500 ng o nga peptides i tātarihia ma te whakamahi i te Orbitrap Fusion Lumos Tribrid papatipu hihiko kua mau ki te puna nano-ESI i whakaahuahia i runga ake nei.I wehea nga peptides i runga i nga waahanga hokohoko RP-HPLC (75 μm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) me nga pou RP-HPLC tātari (75 μm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), kua whakakiia e rua ki te 2 μm.rōnaki mai i te 8% ki te 35% ACN i roto i te 60 meneti, ka piki ake ki te 98% B i roto i te 6 meneti i te tere rere o te 300 Nl/min.MS spectra (350-1500 m/z) i kohia me te taumira o 60,000, AGC 4 × 105, me te wa whakauru nui o te 50 ms.I wehewehea nga katote kua tohua e te HCD i roto i nga huringa 3 s me te kaha tukinga o te 30%, he matapihi wehe tapawha o te 1.6 m/z, me te taumira o te 15000. Ko te 5 × 104 tandem mass spectrometer AGC ūnga me te wa wero nui o 22 ms i whakamahia.Kua whakaritea te whakakorenga hihiri ki te 45 hēkona. Ko nga katote kaore i tautapahia, ko te hunga ranei he utu 1+ me >7+ i paopaohia mo MS/MS. Ko nga katote kaore i tautapahia, ko te hunga ranei he utu 1+ me >7+ i paopaohia mo MS/MS. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ko nga katote katote, katote ranei me te utu o te 1+ me te >7+ i paopaohia mo MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 的离子被拒绝用于MS/MS。 Неуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Ko nga katote, nga katote ranei me nga utu o te 1+ me te >7+ i paopaohia mo MS/MS.
Ko nga tauira takahanga ki runga ki te whakarangatira i nga pirepire NeutrAvidin he rite tonu ki te tātaritanga LC-MS/MS i whakaahuatia i runga ake nei.Tata ki te 50 μg o te lysate i whakamahia hei whakaurunga mo te whakahaere kawenga me te 2 mg o te lysate i whakamahia mo nga tauhohenga paato.I muri i te whakarangatira me te horoinga ki te neutravidin, ka whakakorehia nga porotini herea ma te taapiri i te 50 μl o te paera a Laemmli ki nga pirepire kapia agarose me te kohua i te 95° C. mo te 5 meneti.I tātarihia te whakaurunga uta mana me nga tauira whakarangatira i te pirepire e SDS-PAGE ka whakawhitia ki nga kiriuhi PVDF (Millipore, #ISEQ00010) na roto i nga tikanga paerewa Western blot.I aukatihia nga kiriuhi ki te 5% miraka miraka (Sangon, #A600669) i roto i te TBS kei roto te 0.1% i waenganui-20 (TBST) me te incubated raupapa ki nga antibodies tuatahi me te tuarua.Ko nga paturopi tuatahi i diluted 1:1000 i roto i te 5% miraka waiu i roto i te TBST ka whakakororia i te po i te 4°C.I whakamahia nga paturopi tuarua i roto i te ōwehenga o te 1:5000 ka whakakororia mo te 1 haora i te pāmahana rūma.I kitea nga kiriuhi e te chemiluminescence ma te whakamahi i te punaha whakaahua Chemidoc MP.Ko nga karapa katoa kaore i tapahia o nga para me nga reera kei roto i te ahua kua whakaatuhia hei raraunga mata.
Ko nga antibodies tuatahi i whakamahia i roto i tenei rangahau ko te rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, no. 71992), rabbit anti-FUS monoclonal antibody (CST, no. 67840), rabbit anti-NSUN2 polyclonal antibody (Proteintech, no. 20854-1- AP), antibody anti-mSin3A polyclonal antibody (Abcam, #ab3479), antibody anti-tag monoclonal kiore (TransGen, #HT201-02), antibody anti-β-actin monoclonal antibody (TransGen, #HC201-01), anti rabbit antibody -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), rabbit monoclonal antibody ki CTBP1 (ABclonal, #A11600), rabbit polyclonal antibody ki DUT (ABclonal, #A2901), rabbit polyclonal antibody ki PSMC4 (ABclonal, #A2505), rabbit anti- DNAJB1 polyclonal antibody (ABclonal, # A5504).I whakamahia enei paturopi i te waimehatanga 1:1000 i roto i te miraka 5% i roto i te TBST.Ko nga antibodies tuarua i whakamahia i roto i tenei rangahau ko te anti-rabbit IgG (TransGen, #HS101-01), anti-kiore IgG (TransGen, #HS201-01) i te 1: 5000 dilution.
Hei whakatewhatewha ake mena ka mahi tahi a BRD4 me SFPQ, i whakakikoruatia nga pūtau HEK293T me te BRD4-miniSOG e nui ana te whakahua HEK293T ki nga riu 10 cm.I horoia nga pūtau ki te PBS makariri me te lysed i roto i te 1 ml Pierce IP lysis buffer (Thermo Fisher, #87787) me te aukati protease kore-EDTA mo te 30 meneti i te 4°C.I muri i tera, ka kohia nga lysates i roto i te 1.5 ml ngongo centrifuge me te centrifuge i te 15,871 xg mo te 10 min i te 4 ° C.I hauhaketia te supernatant ka whakakororia ki te 5 µg o anti-V5 antibody monoclonal kiore (CST, #80076) i te po i te 4°C.Horoi tata ki te 50 µl o te pūmua A/G pirepire autō (MCE, #HY-K0202) rua ki te PBS kei roto 0.5% Tween-20.Katahi ka whakakorohia nga lysates pūtau ki nga pirepire autō mo te 4 haora i te 4°C me te hurihanga mai i raro ki runga.Ka wha nga wa ka horoia nga pirepire ki te 1 ml o te PBST buffer ka kohuatia ki te 95°C mo te 5 meneti.I tātarihia nga tauira i runga i nga kaera SDS-PAGE me te whakawhiti ki nga kiriuhi PVDF ma te whakamahi i nga tikanga paerewa Western.I aukatihia nga kiriuhi i roto i te 5% miraka miraka i roto i te TBST, ka whakakororiahia ki te taha o nga antibodies tuatahi me te tuarua.I whakamahia te Antibody Rabbit anti-SFPQ monoclonal antibody (CST, #71992) tuatahi i te ōwehenga o te 1:1000 i roto i te 5% miraka miraka i roto i te TBST ka whakakororia i te po i te 4°C.I whakamahia te IgG anti-rabbit i te ōwehenga o te 1:5000 ka whakakororia mo te 1 haora i te pāmahana rūma.I kitea nga kiriuhi e te chemiluminescence ma te whakamahi i te punaha whakaahua Chemidoc MP.
Ko nga hanganga katoa e whakamahia ana mo te Wehenga Whakaaetanga Whakarewa Mata (SASA) i whiwhihia mai i te Peeke Raraunga Protein (PDB)52 ranei te AlphaFold Protein Structure Database53.I tatauhia te SASA tino mo ia toenga ma te whakamahi i te kaupapa FreeSASA.Ko nga raraunga SASA kua oti me te maamaa noa mo te histidine kua tapaina me ona hoa tata i whakamahia ki te tiki i te tikanga SASA mo ia hanganga.Ko te urunga whakaea (RSA) mo ia histidine i tatauhia ma te wehewehe i te uara SASA tino ki te morahi o te mata toenga e taea ana mo te whakarewa.Ko nga histidine katoa ka tohua he huna mena kei raro iho te RSA toharite i te 20%, mena ka kitea56.
I rapua nga konae mata i roto i te aratau DDA ma te whakamahi i te Proteome Discoverer (v2.5) me te MSfragger (Fragpipe v15.0) i roto i te patengi raraunga pūmua kua whakamanahia e SwissProt kei roto i nga mea poke noa.Ko nga peptides e hiahia ana kia oti te trypsin me nga waahi pakaru e rua kua ngaro, ko te methylation carbamoyl hei whakarereketanga pumau me te waiora methionine hei whakarereketanga hihiri.Ko nga tohu o mua me nga waahanga taumaha kua whakaritea ki te 10 ppm me te 0.02 Da (MS2 Orbitrap), ia. I tangohia nga patu poke, ka tātarihia nga pūmua kia whiwhi i te reiti kitenga teka <1%. I tangohia nga patu poke, ka tātarihia nga pūmua kia whiwhi i te reiti kitenga teka <1%. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициент ложного %. I tangohia nga patu parakino, ka tātarihia nga pūmua kia kitea he reeti rapunga teka <1%.去除污染物命中，过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаруже%. I tangohia nga patu poke, ka tātarihia nga pūmua kia eke ki te reeti pai teka <1%.Mo te tātari ine me te kore e whakamahi tapanga, ka whakamahia te ihirangi pūmua e toru mai i nga tukurua koiora e toru.I mahia te tātaritanga roherohenga pūtau pūmua ma te whakamahi i te Gene Ontology (GO) tātaritanga mai i te DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 me nga papaunga i whakaemihia, i whakaputaina e te roopu Alice Ting.I riro mai te mapi puia mai i a Perseus (v1.6.15.0). I whakamatauria nga whakarereketanga o te nui o te pūmua mo te hiranga tauanga ma te whakamahi i te whakamatautau-t-rua, a, i kitea nga paanga o te pūmua me te nui o te huringa> 2 (mehemea kaore he korero) me te uara p <0.05. I whakamatauria nga whakarereketanga o te nui o te pūmua mo te hiranga tauanga ma te whakamahi i te whakamatautau-t-rua, a, i kitea nga paanga o te pūmua me te nui o te huringa> 2 (mehemea kaore he korero) me te uara p <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. I whakamatauria nga huringa o te kopa i roto i te pūmua mo te hiranga tauanga ma te whakamahi i te whakamatautau-t-rua-hiku, a, i tautuhia nga taurite pūmua ki te huringa o te ihirangi>2 (mehemea kaore i tuhia) me te uara ap <0.05.使用 双边 t 检验检验 蛋白质蛋白质 倍数丰度 的 统计 显着性, 并 确定 蛋白质 命 中 的 丰度 变化> 2 (除非 另 有 说明) 和 p 值 <0.05.使用 双边 t 检验检验 蛋白质蛋白质 倍倍 的 统计 显着性 并 确定确定 命蛋白质 中 的 丰度 变化> 2 (另 有 说明) 和 p 值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. I whakamatauria te hiranga tatauranga o nga huringa piu i roto i te ihirangi pūmua ma te whakamahi i te whakamatautau-t e rua-hiku, a ka whakatauhia nga whakataetae pūmua mo nga huringa ihirangi>2 (mehemea ka tohuhia) me nga uara-p <0.05.I mahia te tātari taunekeneke pūmua ma te whakamahi i te tātaritanga GO me te pātengi raraunga String.
E toru nga tauira koiora i mahia he rite nga hua.I mahia te wetewete tatauranga me te GraphPad Prism (rorohiko GraphPad) me nga papa puia i hangaia me Perseus (v1.6.15.0).Hei whakatairite i nga roopu e rua, i whakatauhia nga uara-p ma te whakamahi i te whakamatautau-t a te tauira-rua.Ko nga pūmua kotahi anake i kitea e rua pea i roto i te roopu whakamatautau i whakauruhia ki roto i nga papa puia, a ko nga uara e ngaro ana i roto i te roopu whakahaere i whakakapihia ki a Perseus mai i te tohatoha noa kia taea ai te tatau te uara-p.Ko nga pae hapa e tohu ana i te toharite ± inenga paerewa.I roto i nga tātaritanga proteomic mo te tātari tauanga, i mau tonu te nui o nga pūmua i puta i roto i nga tauira koiora e rua neke atu.Kaore i whakamahia nga tikanga tatauranga hei whakatau i mua i te rahi o te tauira.Ko nga whakamatautau ehara i te mea ohorere.Kaore nga kairangahau i matapo ki nga mahi i te wa o te whakamatautau me te aromatawai i nga hua.
Mo te roanga atu o nga korero mo te hoahoa ako, tirohia te Ripoata Rangahau Taiao e hono ana ki tenei tuhinga.
Ko nga raraunga spectrometry papatipu i whiwhi i roto i tenei rangahau i tukuna ki te ProteomeXchange Consortium ma te roopu hoa iProX57 i raro i nga raraunga ID PXD034811 (PDPL-MS dataset).Ka whakaratohia nga raraunga mata ki te ahua o nga konae raraunga mata.Ka whakaratohia e tenei tuhinga nga raraunga taketake.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Te mohio ki te takiwa: te whakamahi i te koiora-whakaaro tata ki te tohu i nga matatini pūmua me nga okana mapi. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Te mohio ki te takiwa: te whakamahi i te koiora-whakaaro tata ki te tohu i nga matatini pūmua me nga okana mapi.Gingras, AS, Abe, KT me Raut, B. Te taunga ki nga taiao: te whakamahi i te koiora-whakaaro tata ki te tohu i nga matatini pūmua me nga okana mapi. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. 了解邻里：使用邻近依赖性生物素化来表征蛋白质复合物并细。 Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Te mohio ki te takiwa: whakamahia te whakawhirinaki o te takiwa ki te oranga koiora.Gingras, AS, Abe, KT me Raut, B. Te mohio ki te tata: te tohu o nga matatini pūmua me te mapi o nga okana ma te whakamahi i te koiora-a-papa.o nāianei.Taku whakaaro.Te matū.koiora 48, 44–54 (2019).
Geri, JB et al.Maheretia te taiao moroiti ma te whakawhiti i te kaha o Dexter ki nga pūtau aukati.Pūtaiao 367, 1091–1097 (2020).
Hertling, EL et al.Ka kitea e nga whatunga tauine rua-poroteme te whakarereketanga motuhake o te pūtau o te taunekeneke tangata.Pūtau 184, 3022–3040.e3028 (2021).