Rongorongo

Mauruuru koe mo te toro ki Nature.com.Ko te putanga pūtirotiro e whakamahia ana e koe he iti te tautoko CSS.Mo te wheako pai rawa atu, e taunaki ana matou me whakamahi koe i tetahi kaitirotiro kua whakahoutia (me monohia ranei te Aratau Hototahi ki Internet Explorer).I tenei wa, hei whakarite i te tautoko tonu, ka tukuna e matou te waahi kaore he momo me te JavaScript.
Kua whanakehia e nga pūtau mate pukupuku nga momo tikanga hei hinga i te ahotea o te pūkoro me te ahu whakamua tonu.Ko te Protein kinase R (PKR) me tana kaiwhakahohe pūmua (PACT) ko nga kaiwhakautu tuatahi e aro turuki ana i nga momo tohu ahotea e arai ana ki te aukati i te tipu o te pūtau me te apoptosis.Heoi, ko te whakaritenga o te ara PACT-PKR i roto i nga ruma mate pukupuku kare tonu i te mohiotia.I konei, i kitea e matou ko te RNA kore-waehere roa (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) e uru tika ana ki te aukati i te huarahi PACT-PKR me te whakatairanga i te tipu o te mate pukupuku.Ma te whakamahi i te tirotiro mahi nui o te CRISPRi 971 lncRNA e pa ana ki te mate pukupuku, i kitea e matou ko te DARS-AS1 e pa ana ki te whakanui ake i te tipu o te pukupuku pukupuku.Na reira, ko te paato a DARS-AS1 ka aukati i te tipu o te pūtau me te whakatairanga i te apoptosis pūtau mate pukupuku i roto i nga momo raina pūtau mate pukupuku i roto i te vitro me te tino whakaiti i te tipu o te pukupuku i roto i te vivo.Ma te miihini, ka hono tika te DARS-AS1 ki te rohe whakahohe PACT me te aukati i te taunekeneke PACT-PKR, na reira ka whakaiti i te whakahohenga PKR, te eIF2α phosphorylation, me te aukati i te mate o te pūtau apoptotic.I roto i te haumanu, ko te DARS-AS1 e whakaatuhia ana i roto i nga mate pukupuku maha, me te nui o te korero o tenei lncRNA he tohu mo te mate kino.Ko tenei rangahau e whakamarama ana i nga ture mate pukupuku o te huarahi PACT-PKR na DARS-AS1 lncRNA me te whakarato i tetahi atu whaainga mo te mate pukupuku me te maimoatanga.
Ko te kaha ki te urutau ki te ahotea he ahuatanga nui o te oranga me te tipu o nga pūtau mate pukupuku.Ko te pikinga tere me nga tohu o te mate pukupuku o te mate pukupuku i roto i nga taiao moroiti kino—te korenga matūkai, te hypoxia, me te pH iti—e taea ai te whakakorikori i nga huarahi tohu mate.Ko te whakakore i nga ira tairongo penei i te p535, nga poroteina ohorere wera 6, 7, KRAS8, 9, me HIF-110, 11, 12, 13 ka kitea i nga wa o te mate pukupuku, na reira ka aukati i te apoptosis me te whakatairanga i te oranga.
Ko te Protein kinase R (PKR) he pūoko ahotea nui me te kinase subunit o te eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), he kaiwhakahaere whakamaori e hono ana i te ahotea pūtau ki te mate pūtau.Ko te PKR i tohuhia i te tuatahi he pūmua pareketo na te kitenga o te RNA paerua-rua (dsRNA) ke.I runga i te whakahohenga, PKR phosphorylates eIF2α ki tautāwhi i viral me pūtau pūmua synthesis14,15,16.Ko te PACT (PKR activator protein) kua tohua ko te tuatahi o te PKR activator protein i te kore o dsRNA17,18,19,20,21,22,23.Na roto i te taunekeneke tika me PKR, ka tukuna e te PACT nga taumahatanga rereke (te matekai serum, te peroxide, te maimoatanga arsenite ranei) ki nga huarahi tohu tohu PKR me te awa.Hei taapiri atu ki te eIF2α phosphorylation, ko te whakahohenga PKR-whakawhitiwhitinga PACT e whakaohooho ana i nga momo huihuinga e pa ana ki te urupare ahotea, tae atu ki te whakarereketanga o te mana redox ma te ara PI3K/Akt24, te whakapai ake i te tirotiro kino o te DNA ma te p5325,26 me te NF-κB27,28 Regulates transcription, 29. I runga i to raatau mahi nui ki te whakautu ahotea, te whakatipu, te apoptosis me etahi atu mahinga pūtau matua, ko te PKR me te PACT e kii ana i nga whaainga rongoa mo nga mate maha, ina koa te mate pukupuku30,31,32,33.Heoi, ahakoa tenei mahi pleiotropic me te hiranga koiora, ko te whakaritenga o te mahi PACT/PKR i roto i nga ruma mate pukupuku e mau tonu ana.
Ko nga lncRNA he tuhinga nui ake i te 200 nucleotides kaore he pumanawa whakawaehere pūmua.Mai i te mea kua tautuhia e nga kaupapa whakaraupapa ira ira tangata nga mano tini lncRNA, 35,36 kua whakapau kaha ki te whakamarama i o raatau mahi koiora.Kua kitea e te tipuranga rangahau he maha nga lncRNA e uru ana ki roto i te maha o nga mahi koiora37 tae atu ki te whakahaerenga o te koretake o te X-chromosome38,39, te tuhi40, te tuhi41,42, te whakamaoritanga43 tae atu ki te tipu o te mate pukupuku44,45,46,47.Ko enei rangahau i kii he maha nga lncRNA e uru ana ki te huarahi PACT/PKR.Ko tetahi o nga rangahau i whakaatu ko lncRNA ASPACT i aukati te tuhi PACT me te whakanui ake i te pupuri karihi o PACT mRNA.Ko etahi atu rangahau kua whakaatuhia ko te lncRNA nc886 e herea ana ki te PKR me te aukati i tana phosphorylation49,50.I tenei wa, ko te lncRNA e whakahaere ana i te whakahohenga a PACT-takawaenga PKR kaore ano kia korerotia.
Ko te Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) kua tohua he lncRNA51,52,53,54 oncogenic.Na roto i te whakaritenga o te miP-194-5p53, te miP-12952 me te miP-532-3p51, kua whakaatuhia te DARS-AS1 ki te whakatairanga i te tipu o te mate pukupuku o te renal cell renal cell, te carcinoma thyroid me te mate pukupuku kore-iti.I kitea ano e Tong me nga hoa mahi ko DARS-AS1 te whakatairanga i te ahunga whakamua o te myeloma ma te pupuri i te pumau o te pūmua 39 (RBM39) RNA-binding motif.Heoi ano, karekau he rangahau i whakahaeretia mehemea kei te uru tenei lncRNA ki te whakahaerenga o te PACT-PKR activation me te whakautu ahotea o nga pūtau mate pukupuku.
I konei, i mahia e matou he mata ngaro-o-mahi nui ma te whakamahi i te punaha CRISPRi me te whakatau ko te DARS-AS1 lncRNA e whakatairanga ana i te tini o nga momo pukupuku pukupuku.I tua atu, kua tautuhia e matou he tikanga nui: Ko te DARS-AS1 e hono tika ana ki te PACT, te aukati i te here PACT me te PKR, te aukati i te phosphorylation o te eIF2α, he papa iti ake o te PKR, me te mutunga ka aukati i te mate o te pūtau apoptotic.Hei whakamutunga, ka whakaatuhia e ta maatau mahi te DARS-AS1 lncRNA hei kaiwhakahaere o te huarahi PACT-PKR me te whainga pea mo te maimoatanga mate pukupuku me te mate pukupuku.
Kua kitea e te maha o nga rangahau tohu ira ira e hia rau nga lncRNA e pa ana ki te mate pukupuku.Heoi ano, kare e mohiotia ana a raatau mahi56.Hei tautuhi i nga kaitono o te lncRNA whai mana e uru ana ki te mate pukupuku, i mahia e matou he mata mate-o-mahi mo te whakaheke i te tipu i roto i te SW620 raina pukupuku mate pukupuku colorectal ma te whakamahi i te punaha CRISPRi (Fig. 1a).Ko te ahuatanga motuhake o te SW480 me te SW620 nga raina pukupuku pukupuku o te koroni ko te mea i puta mai i nga pukupuku tuatahi me te tuarua i roto i te manawanui kotahi.He whakataurite nui tenei mo te ako i nga huringa ira i roto i te ahu whakamua o te mate pukupuku koroni.Na reira, i wetewetehia e matou nga tuhinga o nga raina pukupuku mate pukupuku tae (SW480 me SW620) ma te whakamahi i te raupapa RNA me te kohikohi i etahi lncRNA mahi mai i nga tuhinga kua whakaputaina.I runga i enei hua, i hangaia e matou he whare pukapuka sgRNA kua huihuia kei roto 7355 sgRNA oligos e aro ana ki te 971 lncRNA e pa ana ki te mate pukupuku me te 500 sgRNA oligos kaore i arohia mo te mana kino (Raraunga Tāpiri 1).
Whakaaturanga mahere mo te tirotiro ma te whakamahi i te punaha CRISPRi.b sgRNA whakarangatira i muri i te tirotiro.Ko te raina iraira whakapae e tohu ana i te roko2 (huringa takai) = ±0.58.Ko te raina iraira poutū e tohu ana i te uara p = 0.05.Ko nga ira pango e tohu ana i te sgRNA kore-whaainga (kua tohua hei NC).Ko nga ira whero he sgRNA e aro ana ki te DARS-AS1.Ko nga ira puru he sgRNA e aro ana ki te LINC00205, he lncRNA oncogenic i whakaahuahia i mua.huringa takai = (te panui noa, te ra 17)/(te panui noa, te ra 0).c DARS-AS1 sgRNA knockdown i aukati te tipu o te pūtau.Ko nga pae hapa e tohu ana i te ± inenga paerewa o nga whakamatautau e toru.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01 rua-hiku Te whakamatautau-t a te tauira.d te korero DARS-AS1 i roto i nga pukupuku (raraunga TCGA).em Whakaaturanga o DARS-AS1 i roto i nga tauira noa me nga tauira puku mai i nga turoro me te BLCA, KIRC, PRAD, LUSC, UCEC, LUAD, LIHC, KIRP, me te COAD, ia (TCGA dataset).I riro mai nga uara-p ma te whakamahi i te whakamatautau-t a te tauira takirua takirua.
Whai muri i te hanga i te plasmid me te kapi i te lentivirus, i whakawhitia e matou te raina o te mate pukupuku o te dCas9-SW620 me te whare pukapuka i runga ake nei i roto i nga whakamatautau mate motuhake e wha.Ko te tini o te mate (MOI) mo enei mate ko te 0.1-0.3, e tohu ana ka taea anake te whakawhiti i ia pūtau me te sgRNA kotahi.I muri i nga ra 18 o te ahurea in vitro, ka heke, ka piki ake ranei te tohu whakarangatira o nga sgRNA whainga i muri i te tirotiro, i te mea ko te maha o nga oligonucleotides whakahaere kore-whakaarohia kaore i whakarereketia ki te ahua o mua o te tirotiro, e tohu ana he tino mata motuhake to taatau whaainga. whare pukapuka.raihi.1b me te ripanga taapiri 1). Ko te LINC00205, i korerohia i mua ki te whakatairanga i te mate pukupuku pukupuku me te mate pukupuku ate mate58,59,60, i tirotirohia (log2 (foldchange) <−0.58, p uara <0.05), e whakau ana i te pono o tenei tirotiro (Fig. 1b). Ko te LINC00205, i korerohia i mua ki te whakatairanga i te mate pukupuku pukupuku me te mate pukupuku ate mate58,59,60, i tirotirohia (log2 (foldchange) <−0.58, p uara <0.05), e whakau ana i te pono o tenei tirotiro (Fig. 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Ko te LINC00205, i korerohia i mua ki te whakatairanga i te haere o te mate pukupuku o te huhu me te mate pukupuku ate58,59,60, i whakakorehia (log2 (whakarereketanga) <-0.58, p-value <0.05), e whakau ana i te pakari o tenei tirotiro (Fig.1b) . Linc00205 之前 被 报道 可可 肺癌 肺癌 和 肝癌 进展 58,60, 被 筛 选选 掉 (倍数倍数2 (倍数倍数) <-0.58, p 值值 筛选 的 可靠性 (图 1b). Linc00205 之前 被 报道 可可 肺癌 肺癌 和 肝癌 进展 58,60, 被 筛 选选 掉 (倍数倍数2 (倍数倍数) <-0.58, p 值值 筛选 的 可靠性 (图 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис .1b). Ko te LINC00205, i korerohia i mua ki te whakatairanga i te mate pukupuku o te pukupuku me te ate 58,59,60, i whakakorehia (log2 (hurihuri) <-0.58, p-value <0.05), e whakapumau ana i te pakari o tenei tirotiro (Fig. 1b).
I roto i nga lncRNA katoa i whakamatauria, i tirotirohia ano te DARS-AS1, me nga oligonucleotides sgRNA cognate e toru i tino heke i muri i nga ra 18 o te ahurea, e kii ana ko te paheketanga o tenei lncRNA ka heke te tipu o te mate pukupuku (Fig. 1b).I tautokohia ano tenei hua e te tātaritanga WhM i roto i nga pūtau mate pukupuku colorectal e whakaatu ana ko te tere o te tipu o nga pūtau knockdown DARS-AS1 i haurua noa iho ki nga pūtau whakahaere (Whakaahua 1c) me te rite ki nga purongo o mua mo etahi atu momo mate pukupuku.: te mate pukupuku o te whatukuhu, te mate pukupuku taikaro me te mate pukupuku pūtau kore-iti51,52,53,55.Heoi ano, ko ona mahi me nga tikanga ngota i roto i te mate pukupuku colorectal kare tonu i te tirotirohia.Na reira, i whiriwhiria e matou tenei lncRNA mo etahi atu rangahau.
Ki te ako i te korero DARS-AS1 i roto i nga turoro, i tirotirohia e matou nga tauira pukupuku 10,327 mai i te kaupapa Cancer Genome Atlas (TCGA).Ko o maatau hua e whakaatu ana ko te DARS-AS1 he whanui te whakaatu me te tino whakatikatika i roto i nga pūtau hauora i roto i nga momo pukupuku, tae atu ki te koroni adenocarcinoma (COAD), renal clear cell carcinoma (KIRC), me te renal papillary cell carcinoma (KIRP)..He iti rawa (Whakaahua 1d me te Whakaaturanga Tāpiri 1a, b). Ko te tātaritanga o nga tauira hauora/tumor takirua i whakapumau i te whakaaturanga tino teitei ake o te DARS-AS1 i roto i nga pukupuku o te pukupuku urothelial carcinoma (BLCA), te whatukuhu renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), ate hepatocellular carcinoma (LIHC), whatukuhu renal papillary cell carcinoma (KIRP), me te colon adenocarcinoma (COAD) (p uara <0.05) (Fig. 1e–m) . Ko te tātaritanga o nga tauira hauora/tumor takirua i whakapumau i te whakaaturanga tino teitei ake o te DARS-AS1 i roto i nga pukupuku o te pukupuku urothelial carcinoma (BLCA), te whatukuhu renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) , uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC), lung adenocarcinoma (LUAD), ate hepatocellular carcinoma (LIHC), whatukuhu renal papillary cell carcinoma (KIRP), me te colon adenocarcinoma (COAD) (p uara <0.05) (Fig. 1e–m) .Ko te tātaritanga o nga tauira hauora/tumor takirua i whakau i te whakaatu tino teitei ake o te DARS-AS1 i roto i te pukupuku urothelial carcinoma (BLCA), te renal cell renal and renal cell carcinoma (KIRC), prostate adenocarcinoma (PRAD), lung squamous cell carcinoma (LUSC) pukupuku., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , mate pukupuku endometrial o te corpus uteri (UCEC), adenocarcinoma o te huhu (LUAD), hepatocellular carcinoma o te ate (LIHC), papillary cell carcinoma o te whatukuhu (KIRP), me te adenocarcinoma o te koroni (COAD) (p uara < 0.05) (Fig. 1e– m) .配对配对 / 的 的 分析 进一步 证实 了 了 了 了 尿路 上尿路 皮癌 (blca 上 皮癌 (blca 透明 细胞癌 (Kirc), 前列 腺腺癌 (Prad), 肺鳞状 细胞癌 的显着 更 高 表达, 子宫体子宫 内膜 癌 (ucec), 肺腺癌 (Lead), 肝肝 细胞癌 (lihc), 肾 肾 乳头状 细胞癌 (Kirp) 和结肠腺癌 (p 值<0.05）（图1e-m） .配配 健康 健康对 的 的 分析 证实 了 dars-os1 在 尿路 上 皮癌皮癌 皮癌皮癌, 肾 肾 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 细胞癌 前列 前列 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌 腺腺癌(Lusc) 肿瘤 的 的 的 的 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 中 显着 中 中 中 中 显着 中 中 中 显着 显着 中 中中.癌 （kirp） （coad） （p 值<0.05）（图1e-m） .Ko te tātaritanga o nga tauira takirua hauora/puku i tautoko ake i te mahi a DARS-AS1 i roto i te pukupuku urothelial carcinoma (BLCA), te mate pukupuku renal cell renal (KIRC), te prostate adenocarcinoma (PRAD), me nga pukupuku pukupuku squamous cell (LUSC).экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -m). te whakapuaki i roto i te mate pukupuku uterine corpus (UCEC), te adenocarcinoma pūkahukahu (LUAD), te mate pukupuku hepatocellular (LIHC), te mate pukupuku papillary renal (KIRP), me te koroni adenocarcinoma (COAD) (p uara <0.05) (Whakaahua 1e -m).Ko enei hua e tohu ana ko te DARS-AS1 he whanui me te tino whakaatu i roto i nga momo mate pukupuku.
Na te mea ko te DARS-AS1 me te DARS (te ira e whakawae ana i te whenu antisense) he rite te kaiwhakatairanga me te noho ki te taha o tetahi ki tetahi, i hangaia e matou te shRNA ki te patuki i te DARS-AS1 engari kaua ko DARS (Taupiri Fig. 2a,b me te Ripanga Tāpiri 2). .I tua atu i te SW620, i whakamahia ano e matou etahi atu raina waea e toru e tino whakaatu ana i te DARS-AS1 ki te ako i te kaha me te mahi o te shRNA knockdown (Taupiri 3).Ko o maatau hua i tohu ko nga shRNA katoa e toru i whakawhanakehia i tutuki i te iti rawa o te 80% DARS-AS1 knockdown pai me te iti o te paanga ki te nui o te DARS mRNA (Taupiri Fig. 2c-f).I tua atu, i kitea e matou ko te DARS-AS1 knockdown me enei shRNAs i tino whakakorehia te tipu o te tipu i roto i nga raina pukupuku mate pukupuku SW620 (49.7%) me te HCT116 (27.7%), te raina pukupuku mate pukupuku MBA-MD-231 (53.4%).) me te HepG2 hepatoma cell line (92.7% te whakahekenga), me to ratou kaha ki te hanga i nga waahi kaore i tuhia (te whakahekenga toharite o ~ 50.8%, 44.6%, 40.7% me te 75.7% mo ia raina pūtau) (Fig. 2a,b).I roto i te SW620, ko nga hua o te whakamatautau i te hanganga o te koroni i whakapumautia ake ko te DARS-AS1 shRNA i tino whakakorehia te tipu o te pūtau me te hekenga toharite o te 69.6% (Fig. 2c).
Te paanga o te mana whakahaere shRNA me te DARS-AS1 shRNA i runga i te tipu o te pūtau (a) me te hanganga o te spheroid (b) i roto i te SW620, HCT116, MBA-MD-231, me nga pūtau HepG2.c Te paanga o te mana shRNA me te DARS-AS1 shRNA ki te hanga koroni i roto i nga ruma SW620.Te tipu o te pūtau (d), te hanga spheroid (e), me te hanganga koroni (f) o nga pūtau SW620 e kaha ake ana te korero DARS-AS1.Ko nga raraunga kua whakaatuhia ko te toharite ± ine rereke o nga whakamatautau e toru.* p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, me *** p ≤ 0.001 na te whakamatautau-t a te tauira-rua.
Hei whakakii i nga rangahau mate-o-mahi, i muri mai ka hangaia e matou nga pūtau SW620 e kaha ake ana te korero DARS-AS1 (Taupiri Pikitia 2g).Ko te overexpression DARS-AS1 i tino piki ake te tipu o te pūtau (1.8-fold), te hanganga o te spheroid kore (1.4-fold), me te hanganga koroni (3.3-fold) i roto i nga ruma SW620 (Fig. 2d-f).I whakamanahia e matou tenei hua ma te whakamahi i tetahi atu raina pūtau DARS-AS1, A549.Ko tenei pikinga ake o nga pūtau na te DARS-AS1 overexpression i kitea ano i roto i nga pūtau A549 (Taupiri Fig. 2h, i me te Ripanga Tāpiri 3).Ko enei rangahau hua me te ngaro e whakaatu ana ko te DARS-AS1 e whakatairanga ana i te tipu o te mate pukupuku i roto i te vitro.
Ki te torotoro i te tikanga o raro e whakahaere ana a DARS-AS1 i te tipu o te pūtau, i mahia e matou he tātaritanga kume-iho RNA ki te tautuhi i ona hoa here pūmua pea.Ko nga hua o te RT-qPCR i whakaatu ko te 86.2% o DARS-AS1 kei roto i te cytoplasm o nga pūtau SW620 (Taupiri Fig. 3a).Ko te DARS-AS1, ko te pseudoRNA ranei i tuhia i roto i vitro, i tuhia ki te SW620 lysates pūtau ka whai i te wehenga SDS-PAGE.I kitea e te whakakikoruatanga hiriwa o muri mai he roopu motuhake (~ 38 kDa) i tino whakarangatirahia i roto i nga tauira kume DARS-AS1 engari kaore i roto i nga tauira RNA, pirepire ranei (Fig. 3a).Ko tenei roopu i tohuhia he pūmua whakahohe PKR (PACT) na te mass spectrometry (MS) ka whakapumautia ano e te immunoblotting i roto i nga raina pūtau SW620, HCT116, me HepG2 (Fig. 3a,b).Ko te whakarangatiratanga o te DARS me nga paati PACT e pa ana - PKR me TRBP - i tirotirohia ano ma te whakamahi i te tātaritanga RNA na te Western blotting (WB).Ko nga hua i tohu kaore i kitea he taunekeneke tika i waenga i te DARS-AS1 RNA me enei pūmua e toru (Taupiri Fig. 3b).Ko te taunekeneke motuhake i waenga i te DARS-AS1 me te PACT i whakapumautia ano e te RNA immunoprecipitation (RIP) tātaritanga, i whakaatu ko DARS-AS1 i tino whakarangatirahia i roto i nga anti-PACT antibodies engari ehara i etahi atu RNA mana (Whakaahua 3c).Hei whakatau mena ka taunekeneke tika a DARS-AS1 me te PACT i te kore o etahi atu waahanga pūkoro, i mahia he whakamatautau in vitro biolayer interferometry (BLI) ma te whakamahi i te PACT kua purea.Ko te DARS-AS1 te tapanga-Biotinina, ko te RNA dummy ranei i whakakorikorihia i runga i te streptavidin (SA) biosensors katahi ka whakakororia i roto i te buffer kinetic kei roto 1 μM PACT.Ko te mea nui, ko te PACT e herea kaha ana ki te DARS-AS1 (KD uara ~26.9 nM), engari kaua e peehia te RNA (Whakaahua 3d).Ko enei hua e whakaatu ana i te taunekeneke tika me te hononga nui i waenga i te DARS-AS1 me te PACT.
I tautuhia e te tātari kume RNA ko DARS-AS1 e taunekeneke ana me PACT i roto i nga pūtau SW620.Kei runga ake, te whakapouri hiriwa o nga pūmua e pa ana.I mahia nga immunoblots iti me te anti-PACT antibody.b I mahia te tātari kume-iho RNA i roto i nga ruma HCT116 (runga) me HepG2 (raro).I kitea te whakarangatira PACT ma te immunoblotting.Ko nga whakamatautau cRNA immunoprecipitation (RIP) i mahia i roto i nga ruma SW620 ma te whakamahi i nga antibodies kua tohua.d PACT herenga ānau ki tonu-roa DARS-AS1 ranei mana RNA i whiwhi ma te whakamahi i te biolayer interferometry (BLI).Ko te RNA i kore e nekehia i runga i te streptavidin biosensor.I whakamahia te 1 μM PACT ki te ine hononga.I mahia te whakamatautau kume RNA ma te whakamahi i te DARS-AS1 te roa o te koiora-koiora, kua tapahia ranei (runga).Immunoblot whakaatu PACT riro (raro).f Ko te PACT kua kara kua purea i whakakororiahia ki te DARS-AS1 roa-koioraora, kua tapahia ranei (penei i te e) mo te whakamatautau RIP in vitro.Ko te RNA i tangohia i whakamanahia e RT-qPCR.g Ko te hononga whanaungatanga o nga kongakonga RNA rereke mo te PACT i whiwhi ma te whakamahi i te interferometry biolayer.Mo te tātari, i whakamahia te 100 nM RNA me te 1 μM RAST.h I mahia nga whakamatautau RIP in vitro ma te whakamahi i te PACT kua tapatapahia tonutia, kua tapatapahia ranei.Ko te RNA i tangohia i whakamanahia e RT-qPCR.i Te tere o te tipu o nga pūtau SW620 e whakaatu ana i te DARS-AS1, PACT, e rua ranei.j Ko te whakahua nui o te DARS-AS1 te roa-katoa, kua tapahia ranei i roto i nga pūtau SW620 he rereke nga paanga ki te tipu o te pūtau.k I kitea te apoptosis ma te immunoblotting me te anti-PARP antibody.l Ko te Knockout o DARS-AS1 ka whakaawe i te apoptosis o nga pūtau SW620 e whakaatuhia ana e te cytometry rere.Ko nga raraunga kua whakaatuhia ko te toharite ± ine rereke o nga whakamatautau e toru. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, na te whakamatautau t a te Tauira-rua. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001, na te whakamatautau t a te Tauira-rua. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 na te whakamatautau-t a te tauira-rua. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001, ****p <0.0001 na te whakamatautau-t a te tauira-rua.
Na ka hangaia e matou nga wahanga e toru biotinylated DARS-AS1 RNA na roto i te tuhi in vitro hei tautuhi i te rohe DARS-AS1 e hiahiatia ana mo te hononga PACT (Whakaahua 3e).Ko nga hua o te tātaritanga RNA i whakaatu i taea e ia waahanga te taunekeneke ki te PACT, engari ko te rohe 3'-terminal (384-768 nucleotides tapanga A3) i whakaatu neke atu i te 1-384 nucleotides tapaina A1) (Fig. 3e).He rite nga hua i kitea i roto i te whakamatautau RIP in vitro ma te whakamahi i te PACT recombinant (Whakaahua 3f).I runga ano i enei hua, ko nga whakamatautau ki te here i nga kongakonga RNA kaore i nekehia ki te PACT ma te whakamahi i te BLI i whakaatu ano he pai ake te hononga o te PACT mo A3 (384-768 nt) (te uara KD tata ki te 94.6 nM), i te mea kaore he hononga ki etahi atu waahi.(Whakaahua 3d).
I tirotirohia ano e matou nga rohe here e pa ana ki te PACT.E toru nga waahanga mahi a PACT, e rua o enei e tiakina ana i nga waahi here-a-RNA-rua (dsRBD) me tetahi rohe tuatoru (kua tohua D3) e mahi ana hei whakaoho i nga taunekeneke pūmua.Hei tirotiro i te kaha herenga lncRNA o ia rohe, i hangaia e matou nga huringa e toru i tango i ia waahanga e toru ka mahia he whakamatautau RIP in vitro.Ko o maatau hua i whakaatu ko te whakakorenga o te rohe tuatoru (D3) o PACT i tino whakaiti i tana taunekeneke ki te DARS-AS1 (na te 0.11-fold i whakaritea ki te PACT tonu) i whakaritea ki era atu whakarereketanga e rua (Fig. 3h), i whakaatuhia ko te tukunga. o D3 i mahi tahi me DARS.-AC1.Ka huihuia, ko enei hua e whakaatu ana ko te taunekeneke i waenga i te DARS-AS1 me te PACT ka puta i te tuatahi ma te 3' mutunga o DARS-AS1 me te rohe D3 o PACT.
I kite matou kaore he painga o DARS-AS1 ki te whakapuaki PACT me te PACT kaore he painga ki te DARS-AS1 (Taupiri 3c).Ka tirohia e matou te paanga o te paheketanga o te PACT ki te tipu o nga pūtau.He rereke ki te DARS-AS1, ka piki ake te 1.5-3 nga wa tere ake o nga pūtau whanaunga i te wa i turakina ai te PACT (Taupiri 3d).Ko nga hua o te whakamatautau i te hanganga o te koroni i tohu ko nga ruma i hanga i nga koroni 2-3-fold i muri i te maimoatanga shRNA me te PACT (Taupiri Fig. 3e).Hei whakamatautau mena ka whakatauhia e DARS-AS1 te tipu o nga pūtau na roto i te PACT, i hangaia e matou nga pūtau SW620 e kaha ana te whakahua i te PACT, DARS-AS1, e rua ranei.Ko te korero nui o te PACT i whakaatu i te aukati nui o te tipu o te pūtau (Whakaahua 3i).Ahakoa ko te overexpression DARS-AS1 ia ia i tino whakatairangahia te tipu o te pūtau, kaore he rereketanga nui o te tipu o te tipu o nga pūtau e kaha ake ana i te DARS-AS1 me te PACT.Ko enei hua e kii ana ka taea e te PACT te aukati i te pikinga o te pikinga na te kaha o te korero a DARS-AS1.
Mai i nga rohe rereke o DARS-AS1 he rereke nga mana here PACT, i tirotirohia e matou to raatau awe ki runga i te tipu o te pūtau na roto i nga korero rereke o nga waahanga DARS-AS1.I whakaritea ki etahi atu waahanga e rua, ko te DARS-AS1 i kaha ake te korero i te mutunga o te 3' (384-768 nt), ko te rohe matua e pa ana ki te PACT i DARS-AS1, he kaha rawa atu ki te whakaongaonga i te tipu o te pūtau (Fig. 3j).Ko enei hua e whakaatu ana i te pai o te hononga i waenga i te kaha here me te mahi koiora o DARS-AS1.
Ko te PACT he pūmua pro-apoptotic19.Na reira, i tirotirohia e matou te paanga o DARS-AS1 i runga i te apoptosis.I te mea e tumanakohia ana, ko te paheketanga DARS-AS1 i tino piki ake te wehenga PARP i roto i nga kamera SW620 me te whakanui ake i te waahanga o nga pūtau V-positive annexin i SW620, HCT116, HepG2, me MBA-MD-231 nga raina pūtau (Fig. 3k).3).3f-h), e tohu ana ko te hua anti-apoptotic o DARS-AS1 i roto i nga pukupuku pukupuku he rereke ki te mahi apoptosis-whakaawe a PACT.Ka huihuia, ko enei hua e kii ana ko te tikanga o te mahi oncogenic DARS-AS1 ma te aukati i te mahi PACT.
I muri mai, i tirotirohia e matou nga paanga mahi o te hononga DARS-AS1-PACT.Kua korerohia te PACT ki te whakahohe i te PKR na roto i te taunekeneke tika, ka whakanui ake i te eIF2α phosphorylation, ka whakakorehia te whakamaoritanga me te apoptosis17.Tuatahi, i tirotirohia mena ka pa te DARS-AS1 ki te whakaurunga pukoro o PACT me PKR.I whakaatu mai te moroiti rewharewha confocal ko te PACT me te PKR i tino whakahiatohia i roto i nga ruma SW620 me te tauwaenga o te taurite o te Pearson he 0.72.I tenei wa, ko te kaha ake o te korero a DARS-AS1 i tino whakahekehia te PACT me te PKR-a-rohe (ko te tikanga o te whakareatanga hononga Pearson 0.61) (Whakaahua 4a).Ki te tirotiro mena ka taea e DARS-AS1 te whakarereke i te taunekeneke PACT-PKR, i mahia e matou he whakamatautau co-immunoprecipitation (co-IP) me te anti-PACT antibody i roto i nga lysates pūtau SW620.I tino whakarangatirahia a PKR i roto i te anti-PACT i roto i nga pūtau whakahaere, i te mea ko te whakaora PKR i tino whakahekehia i roto i nga lysates mai i nga pūtau e kaha ake ana te korero DARS-AS1 (Fig. 4b).I whakamahia te PACT me te PKR kua purea mo nga whakamatautau here pūmua in vitro.Na reira, ko nga mea i whakarato i te DARS-AS1 engari kaore he mana RNA i whakaatu i te aukati i te taunekeneke PACT-PKR (Whakaahua 4c).Ko nga hua katoa i whakaatu ko DARS-AS1 i pakaru te korero a PACT me PKR.
Ko te whakaurunga tahi o te PACT me te PKR i roto i nga pūtau whakahaere, i nga pūtau ranei e kaha ake ana te whakamaarama i te DARS-AS1 i kitea ma te whakamahi i te microscopy fluorescence confocal.I pokea nga karihi ki te DAPI.I whiwhi hua tatauranga mai i nga whakaahua 16.b Co-immunoprecipitation (co-IP) whakamahi anti-PACT antibody i roto i nga lysates pūtau o te mana SW620 pūtau, pūtau overexpressing DARS-AS1 ranei.c Kua tapaina he PACT, kua purea te PKR me te tuhi i roto i te vitro me te DARS-AS1 me te RNA whakahianga ranei i incubated mo in vitro tātari here pūmua.I whakamahia nga anti-flag antibodies mo te immunoprecipitation.d Immunoblots ki te tohu paturopi i mahia i roto i SW620 me HCT116 pūtau whakawhiti ki te mana shRNA ranei DARS-AS1-shRNA aru i te matekai serum.Ko nga taumata korero DARS-AS1 i whakarereke i te aro o te pūkoro ki te thapsigargin.I whakawhitihia nga pūtau SW620 me te DARS-AS1 shRNA, DARS-AS1 overexpression plasmid, te plasmid whakahaere ranei.I tukinotia nga pūtau ki te thapsigargin mo nga haora 48 ka whakatauhia te oranga o te pūtau ma te whakamahi i te reagent WhM.f In vitro i tuhia DARS-AS1 ranei dummy RNA me PACT pure i whakamahia mo te in vitro activation assay and immunoblot detection.g Immunoblots e whakamahi ana i enei paturopi i mahia i runga i nga pūtau SW620-ctrl (taha maui) ranei nga pūtau e kaha ana te whakaputa i nga mutants PKR (matau).Ka whakawhitihia enei pūtau me te mana shRNA, DARS-AS1-shRNA ranei ka whai i te matekai serum.h Flow cytometry i whakaatu ko te koretake o te mutant PKR i utu mo te apoptosis i whakaawehia e DARS-AS1 i roto i nga pūtau SW620.i I mahia nga Immunoblots me nga paturopi kua tohua i roto i nga ruma SW620 (maui) HCT116 (matau) ranei.Ko nga pūtau kua whakawhitia me te mana shRNA, te DARS-AS1 shRNA ranei, kua whakakorehia te serum me te taapiri atu ki te 100 nM PKR C16 aukati, DMSO ranei.Pae tauine = 5 µm.Ko nga raraunga kua whakaatuhia ko te toharite ± ine rereke o nga whakamatautau e toru.* p ≤ 0.05 te whakamātautau-t a te tauira-rua.
E whakaponohia ana ko te wa e taunekeneke ana a PACT ki te PKR17, ka taea te phosphorylation PKR i Thr451.Ko o maatau hua i tohu ko te taumata o te phosphorylation PKR i tino whakanuia i roto i nga kamera knockdown DARS-AS1 i muri i te matekai serum (Fig. 4d and Supplementary Fig. 4a).Na reira, i kitea e matou ko te phosphorylation o te eIF2α, te taputapu PKR matua, i tino piki ake e te DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d me te Tāpiri 4a).Ko Thapsigargin he whakapouri ER e puta ai te ER ki te tuku i te Ca2+.Ko te maimoatanga me te thapsigargin kua korerohia ki te whakatairanga i te korero me te whakahohe i te PACT, e mahi tahi ana me te whakahohe i te PKR, ka arahina ki te apoptosis ma te whakanui ake i te eIF2α phosphorylation 18,61.I konei, i whakamahia e matou te thapsigargin hei kaiwhakatairanga o te ara PACT/PKR ki te tirotiro mena ka taea e DARS-AS1 te awhina i nga pūtau ki te hinga i te ahotea ma te aukati i te ara PACT/PKR.I kite matou ko te taumata o te korero DARS-AS1 he pai te hono ki te parenga pūtau ki te thapsigargin.SW620 pūtau overexpressing DARS-AS1 i ora pai ake i te maimoatanga ki te thapsigargin, i te pūtau ki DARS-AS1 knockdown ka kaha ake te whakaraerae (Fig. 4e).I runga ano i enei hua, ko te whakamaaramatanga o DARS-AS1 i whakahekehia te phosphorylation PKR-te thapsigargin (Taapiri 4b).Engari, i muri i te maimoatanga o te thapsigargin, ko te PKR me te eIF2α i phosphorylated ki te taumata teitei ake i roto i nga pūtau knockdown DARS-AS1 i whakaritea ki nga pūtau whakahaere (Taupiri Fig. 4b).Ko te mea whakamiharo, ko te thapsigargin te whakaputa korero DARS-AS1 i roto i te tikanga e whakawhirinaki ana ki te horopeta, ka tohu pea he mahi anti-stress o DARS-AS1 (Taupiri Fig. 4c).I tua atu, i mahia e matou nga whakamatautau whakaoho in vitro hei whakapumau i enei kitenga.I te wa poto, i purea a PKR mai i nga lysates pūtau ma te whakamahi i te anti-PKR antibody, katahi ka whakauruhia ki te PACT recombinant me DARS-AS1 i tuhia i roto i te vitro.I muri i te tauhohenga enzymatic, ka kitea te phospho-PKR ma te whakamahi i te WB.Ko o maatau hua i tohu ko te phosphorylation PKR i tino whakakorehia e DARS-AS1, engari ehara i te mana RNA (Whakaahua 4f).Ko enei hua in vitro me in vivo e kii ana ko DARS-AS1 te aukati i te whakahohenga a PACT-mediated PKR.I te wa ano, i kite ano matou i te heke o te whakaora PACT i te aroaro o DARS-AS1 (Whakaahua 4f).Ko tenei hua ka rite ki nga hua o te in vitro protein binding assay (Whakaahua 4c) me te whakaatu ano i te mahi aukati a DARS-AS1 mo te hononga PACT-PKR.
Ko te Ser246 me te Ser287 i roto i te rohe D3 o PACT e hiahiatia ana mo te whakahohe PKR i raro i te ahotea pūtau.Ko te whakakapinga o nga toenga serine e rua mo te alanine ka puta te PACT mutant (mutD), i whakahohea te PKR i te kore o te ahotea, me te whakakapi mo te alanine (mutA) ka huri te kawa.I te mea kua whakaatuhia e matou te hiranga o tenei rohe ki te hono tika me DARS-AS1, i hangaia e matou enei mutants PACT e rua hei whakamatautau mena ka uru ano enei toenga ki te taunekeneke me te DARS-AS1.Ko te mea whakamiharo, kua ngaro te kaha o nga mutants e rua ki te herea ki te DARS-AS1 (Taupiri Fig. 4d), e kii ana ka hiahiatia te hanganga katoa o te pūmua PACT mo te pai o te taunekeneke me te DARS-AS1.
I tua atu, ko o maatau hua e kii ana ka taea e te DARS-AS1-shRNA te whakakore i te whakahiatotanga o te tipu o te pūtau ka taea te whakahoki mai i tetahi waahanga ma te whakanui ake i te kaha o te PACT mutant (PACTmutA) me tetahi mutant PKR kino (PKRmut) (Taupiri Fig. 4e. e).Ko te nui o te korero o nga mutants tino-kino PKR i whakahekehia te phosphorylation PKR i whakaawehia e te DARS-AS1 knockdown me te eIF2α phosphorylation i roto i nga pūtau kore-serum (Fig. 4g).Ko te mea nui ake, ko te wahanga o nga pūtau apoptotic i whakaawehia e te DARS-AS1 knockdown i whakaitihia ano hoki i roto i nga pūtau e kii ana i te PKRmut (Fig. 4h and Supplementary Fig. 4g).Ko te whakakore i te mahi kinase PKR ka whakararu hoki i te mahi DARS-AS1, na te mea ko nga hua i whakaatu ko te paheketanga o DARS-AS1 he iti noa te whakaohooho i te PKR me te eIF2α phosphorylation i te wa e rongoahia ana nga pūtau me te aukati C16 motuhake (Fig. 4i me te Whakaaturanga 4h).).Ka huihuia, ko o maatau hua e kii ana ko te DARS-AS1 e whakatairanga ana i te tipu o nga pūtau, he iti rawa te waahanga, ma te aukati i te whakahohenga PKR-takawaenga a PACT.
Hei tirotiro ano i te mahi a DARS-AS1 i roto i te tumorigenesis, i mahia e matou i roto i nga whakamatautau vivo ma te whakamahi i te tauira xenograft kiore. Ko nga hua e whakaatu ana ko te paheketanga o DARS-AS1 i tino heke te tipu o te pukupuku i roto i nga kiore (p uara <0.0001) (Fig. 5a). Ko nga hua e whakaatu ana ko te paheketanga o DARS-AS1 i tino heke te tipu o te pukupuku i roto i nga kiore (p uara <0.0001) (Fig. 5a). Результати показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (hei tauira 5а). Ko nga hua e whakaatu ana ko te tukinga DARS-AS1 ka tino whakaiti i te tipu o te pukupuku i roto i nga kiore (p uara <0.0001) (Whakaahua 5a).结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p 值< 0.0001）（图5a）。结果表明，DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）。 Результати показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (рис. 5а). Ko nga hua i whakaatu ko DARS-AS1 knockdown i tino whakaheke te tipu o te pukupuku i roto i nga kiore (p uara <0.0001) (Whakaahua 5a).No reira, i roto i te roopu knockdown DARS-AS1, he nui te hekenga o te rahinga o te puku o te puku mo te 72.9% me te nui o te papatipu puku mo te 87.8% (Whakaahua 5b-d).Ko enei hua e tino tohu ana ka taea e DARS-AS1 te whakatairanga i te tipu o te pukupuku i roto i te vivo.
Nga paanga o te panui DARS-AS1 knockdown i runga i te oncogenesis colorectal i nga kiore tahanga.Ka whakaatuhia nga pihi tipu (a), te rahi o te puku (b), te taumaha (c), me nga whakaahua puku (d).Ko nga pae hapa e tohu ana i te ± SEM. n = 10. ****p < 0.0001, na te whakamatautau t a te tauira-rua. n = 10. ****p < 0.0001, na te whakamatautau t a te tauira-rua. n = 10. ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p <0.0001 rua-hiku Te whakamātautau-t a te Ākonga.n = 10. ****p < 0.0001，通过双尾学生t 检验。 ****p < 0.0001，通过双尾学生t检验。 ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. ****p < 0.0001 te whakamātautau-t a te tauira-rua.I tātarihia e Kaplan-Meier te hononga i waenga i nga taumata korero DARS-AS1 me te oranga katoa o nga turoro me UVM, KICH, KIRP, MESO, GBM, me LGG.Ko nga taumata teitei o te korero DARS-AS1 i roto i nga turoro i runga i te 50% runga;ko te taumata iti o te korero DARS-AS1 i roto i nga turoro i raro i te 50%.I whakatauhia nga uara-p ma te whakamahi i te whakamatautau tohu tohu.f Ko te tauira e whakaarohia ana e DARS-AS1 te whakahaere i te huarahi PACT-PKR me te tipu puku.
Kia pai ake te mohio ki te paanga haumanu o DARS-AS1, i tirotirohia e matou te hononga i waenga i tana korero me te oranga o te manawanui.Na roto i te tātari i te huingararaunga TCGA, i kitea e matou ko te korero DARS-AS1 teitei ake e hono ana ki te uveal melanoma (UVM), renal chromophobia (KICH), renal papillary cell carcinoma (KIRP), mesothelioma (MESO), multiplex.Ko te iti ake o te oranga i tino hono ki te glioblastoma morphosis (GBM) me nga turoro me te glioma roro iti (LGG) (Whakaahua 5e).Ko enei hua e kii ana ka whai waahi nui a DARS-AS1 ki te ahu whakamua o te pukupuku haumanu, a he tohu tohu koiora pea mo nga mate pukupuku maha.
I roto i tenei rangahau, ma te whakamahi i te tirotiro mahi CRISPRi nui-nui, i whakatauhia e DARS-AS1 lncRNA te wikitoria i te ahotea o te mate pukupuku ma te whakahaere i nga kaiwhakautu ahotea e rua, PACT me PKR.Na roto i te taunekeneke tika me te PACT, ka aukati a DARS-AS1 i te whakahohenga PKR-takawaenga o te PACT, na reira ka aukati i te mate o te pūtau apoptotic me te whakatairanga i te tipu o te pūtau (Fig. 5f).Ko te whakatikatika o te DARS-AS1 kua kitea i roto i nga momo mate pukupuku maha, e kii ana ko tana mahi ki te whakatairanga i te oranga o nga pūtau mate pukupuku i raro i nga ahuatanga taumaha ka pa ki nga momo mate pukupuku maha.
Kua tohuhia te PACT he pūmua kaiwhakahohe PKR, a he mahi nui a PACT-mediated PKR activation i roto i nga whakautu ahotea ma te whakahaere i te whakamaoritanga, te whakamaoritanga, te apoptosis, me etahi atu tukanga pūkoro nui62.Mo nga tekau tau, kua ngana ki te mohio ki te ture mo te mate pukupuku o te PACT-PKR cascade.I konei, i kitea e ta maatau rangahau he tikanga rereke o te PACT-PKR i roto i nga pūtau mate pukupuku na roto i te pūtau lncRNA DARS-AS1, e hono tika ana ki te PACT, ka aukati i te taunekeneke PACT-PKR, ka aukati i te whakahohenga PKR me te eIF2α phosphorylation, na reira ka aukati i te apoptosis me te whakaihiihi i te tipu o te mate pukupuku.pūtau.Ko tenei kitenga ka whakamarama i nga whaainga lncRNA pea mo te mate pukupuku me te rongoa.
I whakaatuhia e o maatau raraunga ko te tukitukitanga DARS-AS1 e whakamohio ana i nga pūtau ki te matekai serum me te pikinga nui o te PKR phosphorylated me te eIF2α.Ko enei hua e tohu ana ko te DARS-AS1 e whakatairanga ana i te oranga o te pukupuku pukupuku i raro i nga tikanga kino ma te aukati i te mahi PACT/PKR.He maha atu nga RNA kore-waehere, penei i te ASPACT me te nc886, kei te whakauru ano ki te tuaka PACT/PKR ma te whakaheke i te PACT48 mRNA, te whakahaere ranei i te autophosphorylation ma te here ki PKR49,50,64.I roto ia ratou, ko DARS-AS1 te mahi hei whakararuraru i te roopu PACT-PKR.Ko tenei rangahau e whakarangatira ana i to maatau mohiotanga ki te ture tuaka PACT/PKR me te mahi a nga lncRNA i roto i nga whakautu ahotea.
E toru nga waahanga motuhake o te PACT.Ko ia o nga dsRBD tuatahi e rua e ranea ana ki te whakatutuki i te herenga hononga teitei o te PACT ki te PKR, ko te rohe tuatoru (D3) e hiahiatia ana mo te whakahohe PKR in vitro me in vivo.I whakaatuhia e ta maatau rangahau ko te DARS-AS1 he pai te taunekeneke me te rohe D3 (Fig. 3h).Na te nui o te lncRNA (768 nucleotides), ka taea e te DARS-AS1 te here ki te D3 te aukati tinana i te taunekeneke i waenga i te rohe PACT o dsRBD me PKR, na reira ka aukati i te hononga o PACT me PKR.Ko nga huringa tohu PACT i whakakapi i a Ser246 me Ser287 i te D3 me te alanine, te aspartate ranei i whakararu i tona hononga here mo DARS-AS1, e tohu ana ki te hiranga o te hangahanga me te hiko o D3 i roto i o raatau hononga.Ko etahi atu korero mo tenei tikanga ka hiahiatia a muri ake nei, ma te whakamahi i te tātaritanga matū koiora me te tātari hanganga PACT taumira teitei.
Kua korerohia e nga rangahau o mua ko DARS-AS1 te whakatairanga i te tipu o te pūtau ma te maha o nga tikanga51,52,53.I roto i tetahi tauira, i kitea e nga kaitirotiro ko te DARS-AS1 i whakahou ake i tana ira DARS-whakawaehere antisense ma te aro ki te miP-194-5p i roto i nga pūtau mate pukupuku whatukuhu.Heoi, i roto i te rangahau o naianei, he iti te paanga o te paheketanga o DARS-AS1 ki te tuhi DARS i roto i nga momo mate pukupuku maha, tae atu ki nga mate pukupuku o te tae, te u, me te ate.Na te mea e whakaatu ana nga lncRNA i nga tauira korero motuhake mo te pūtau me te kiko, ka kore pea e tiakina nga tikanga mahi puta noa i nga momo mate pukupuku, tera pea ka whai waahi tenei rereketanga i waenga i o maatau tirohanga me nga aromatawai o mua mo nga momo mate pukupuku.Ko nga rangahau motuhake e hiahiatia ana hei whakamarama i nga tikanga motuhake o nga momo tukanga whaiaroaro me te pathological.
Ko te tātaritanga o nga raraunga haumanu i whakaatu ko te korero a DARS-AS1 i roto i nga pukupuku e hono ana ki te oranga o nga turoro mate pukupuku, e tohu ana i te hiranga o te tuaka DARS-AS1 / PACT / PKR i roto i te mate pukupuku mate pukupuku.Hei mutunga, ko ta maatau rangahau e whakaatu ana ko DARS-AS1 he kaiwhakahaere o te tuaka tohu PACT/PKR, e whakatairanga ana i te tipu o nga pūtau mate pukupuku, me te aukati i te apoptosis i te wa o te whakautu ahotea, e whakarato ana i tetahi atu rarangi rangahau me te aro nui mo te rangahau a meake nei ki nga maimoatanga pea. .
Ko nga raina pūtau tangata SW620, A549, MBA-MD-231, HCT116, HepG2 me HEK293T i riro mai i te Hanganga Rauemi Raina Waea Motu i Haina.I mau tonu nga pūtau katoa i roto i te reo DMEM (DMEM, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) kua taapirihia ki te 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) me te 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) i te 37 ° C, 5% CO2.incubator.
Anti-PACT, Abcam (ab31967);Anti-PKR, Abcam (ab184257);Anti-PKR (phospho-T451), Abcam (ab81303);Anti-Haka, Abcam (ab125243);Anti-eIF2α, Abcam (A0764));anti-eIF2α (phosphorus S51), Abcam (ab32157);anti-PACT (phosphorus S246), Abgent (AP7744b);anti-β-tubulin, CST (2128);kiore noa IgG, CST (5415S);rapeti noa IgG, CST (2729S).Ko nga antibodies i diluted 1:1000 i roto i te PBST mo te Western blotting me te 1:100 mo te IP.
I whakawhanakehia nga sgRNA ma te whakamahi i tetahi taputapu e waatea ana ki te whanui ko CRISPR-ERA66.I whakamahia e matou nga tawhā taputapu taunoa mo te whakawhanaketanga sgRNA me te algorithm i whakatauhia nga waahi here sgRNA i te rohe 3 kb.e arotahi ana ki TSS.Ko nga puna o te sgRNA oligonucleotides i whakahiatohia i CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ka kohia ki nga plasmids pgRNA tangata (Addgene #44248).Ko te katoa o te 12 µg o te pgRNA plasmid kua whakahiatohia, 7.2 µg o te psPAX2 (Addgene #12260), me te 4.8 µg o pMD2.G (Addgene #12259) i whakawhitia tahi ki roto i te 5 x 106 HEK293T dishes ma te whakamahi i te DNAagent Transfection dishes i roto i te DNA 10fect Transfection 10. pūtau (CWBIO, Beijing, Haina) e whai ana i nga tohutohu a te kaihanga.I kohia nga supernatant kei roto i te huaketo i te 48 me te 72 haora i muri i te whakawhiti me te tātari ma te tātari 0.45 µm.Mo te tirotiro, i whiwhi nga pūtau SW620 e whakaatu ana i te pūmua whakakotahitanga dCas9/KRAB ma te whakawhiti huaketo.Ko nga pūtau SW620 kua whakarereketia i pangia e te whare pukapuka huaketo i roto i nga whakamatautau mate motuhake e wha i te MOI o 0.1-0.3 me te tauira ki te 2 μg / ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) mo nga ra 2.I muri mai, ka whakatipuhia nga pūtau mo nga ra 18 in vitro me te iti rawa o te kapi whare pukapuka o te 500 pūtau/sgRNA mo te tirotiro.
I tangohia te DNA Genomic i runga i nga tohutohu a te QIAamp DNA Blood Midi Kit (QIAGEN, Düsseldorf, Germany; 51183).Katoa, 100 μg o te DNA genomic mo ia tukurua koiora i whakamahia hei hanga i te whare pukapuka.Ko te rohe sgRNA i whakanuia e nga rauna e rua o te PCR me te hono ki te tohu tohu.
I purea nga hua PCR ma te whakamahi i te ranu NucleoSpin® me te kete purei PCR (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) me te ine ma te whakamahi i te kete rapu DNA taurua a Qubit™ HS (Thermo Fisher Scientific; Q32854).
I whakamahia te whakamätautau WhM ki te ine i te pikinga o nga pūtau.I ruia nga pūtau ki roto i nga pereti 96-puna i te kiato tuatahi o te 2000 pūtau/puna.I whangangahia te maha o nga pūtau i ia ra i te wa kua tohua mo te katoa o nga ra 4-6.Mo ia puna, 20 μl o te reagent MTS (Promega) i waimeha ki te 100 μl o DMEM, i whakakororia ki nga ruma mo te 4 haora i te 37 ° C, katahi ka inehia te OD490.
I kitea te kaha mo te tipu karekau ma te wetewete i te hanganga o nga awheawhe.He poto, 2000 nga pūtau i whakawhitia me te shRNA DARS-AS1, te mana whakahaere ranei i te shRNA i whakatipuhia i roto i nga miihini taapiri iti-iti (Corning) me te whakarereke reo ia 4 ra.Ka tatauhia nga spheroids i muri i nga ra 14.Ko nga pūtau 500 i whakawhitia me te DARS-AS1 overexpression plasmid, he plasmid mana ranei i whakamahia mo te whakamatautau whakarei ake, mehemea kaore i whakarereketia te tikanga.
I tuhia te RNA ma te whakamahi i te T7 RNA polymerase me te biotin-16-UTP (Roche 1138908910) kia rite ki nga tohutohu a Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440).Ko nga mea tuatahi e whakamahia ana i konei kua whakarārangihia ki te Ripanga Tāpiri 4.
Ko nga rohe PACT-whakawaehere pūmua, PKR ranei i kohia ki te pET15b (Addgene #73619) ka huri hei BL21(DE3).I whakakororiahia nga huakita i te po kotahi ki roto i te LB i whakawhiwhia ki te ampicillin, katahi ka waimeha 100 ki te LB hou.I te taenga o te OD600 o te reo ki te 0.8, ka taapirihia te 1 mM IPTG ki te whakaputa korero pūmua.I muri i te hekitanga i te po me te wiri ngawari (250 rpm i te 20°C), ka kohia te pire pūtau ma te centrifugation (4000 rpm, 10 min, 4°C).Whakaorangia ano te pire pūtau i roto i te lysis buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 1 mM PMSF) ka whakamau ki runga tio mo te 30 min, ka sonicate (15 min, 5 s on/off, i runga i te huka) me te centrifuge (13,000). rpm)., 30 min, 4°C).Ka utaina te supernatant ki runga i te Ni-NTA resin (QIAGEN) 3 nga wa i te 4°C, ka horoia e 4 nga wa ki te horoi horoi (50 mM Tris, pH 8.0, 40 mM imidazole, 250 mM NaCl) ka 3 nga wa, me te tapeke. o te 10 ml eluent buffer (50 mM Tris, pH 8.0, 250 mM NaCl, 300 mM imidazole).I whakatauhia te pūmua purea ma te whakamahi i te WB ka whakatauhia te kukū ma te whakamahi i te kete whakamatautau pūmua Qubit™ (Thermo Fisher Scientific; Q 33212).
I mahia nga whakamatautau RIP pera i nga korero o mua, me nga whakarereketanga.He poto, 1x RIP buffer (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40, RNasin ribonuclease inhibitor (Promega), PMSF (Beyotime Biotechnology), 1 mM DDM, protease) lyses cytostatic 1 x 107 cocktail (Roche, 1 mM DTT) me te centrifuge i te 13,000 rpm mo te 15 meneti i te 4 °C.Ko te supernatant ka whakakororia ki te pūmua A+G pirepire autō (Millipore) hono ki te 5 μg o anti-PACT antibody (Abeam) ranei IgG (CST).I horoia nga pirepire e 5 nga wa ki te 5x RIP buffer, ka keri ki te proteinase K (NEB).I tangohia te RNA me Trizol ka whakatauhia e RT-qPCR.Ka whakaatuhia nga kaupapa tuatahi ki te Ripanga Tāpiri 5.
I mahia te whakamatautau RIP in vitro i runga i te kawa whakamatautau RIP paerewa kua whakarereketia.Ko te katoa o te 5 pmol o te RNA kua tuhia i roto i te vitro i diluted 1x ki te RIP buffer ka rea ​​ma te heki i te 65°C mo te 5 meneti ka whai i te whakamahana puhoi ki te pāmahana rūma.E 5 pmol o nga pūmua PACT kua tapaina ki te haki, kua whakahurihia ranei i purea mai i te E. coli.Whakanuia ki te RNA kua whakahouhia mo te 2 haora i te 4°C ka whai i nga tikanga o runga mo te tātari RIP mo te IP anti-haki.
Mo te tātaritanga toronga RNA, 1x107 nga pūtau i lysed ki te 1xRIP buffer.I muri i te centrifugation i te 13,000 rpm mo te 15 min i te 4°C, ka tukuna te supernatant ki te 30 μl o te streptavidin magnetic beads (Beckman) mo te 2 h i te 4°C.Ko te lysate kua purea ka tukuna ki te rewena tRNA me te incubated ki te 40 pmol o te RNA kua whakahouhia i te po i te 4 ° C, katahi mo etahi atu haora 2 me te 20 μl o nga pirepire autō streptavidin hou kua aukatihia ki te BSA.Ko te taahiraa horoi e 4 nga wa me te 5x RIP buffer me te 4 nga wa me te 1x RIP buffer.Ko nga pūmua e rite ana i whakahekehia ki te peera o te biotin elution (25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 12.5 mM D-biotin, PMSF) ka wehea ki runga NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen).Whai muri i te paninga hiriwa (Beyotime Biotechnology), ka tangohia etahi roopu ka wetewetehia e MS.
I mahia he tātaritanga Co-IP hei whakamatautau i te taunekeneke i waenga i te PACT me te PKR.I te wa poto, i whakaritea nga lysates supernatant na roto i te incubating 1 x 107 lysed cell in 1 x RIP buffer whai muri i te centrifugation i te 13,000 rpm mo te 15 meneti i te 4°C.I utaina nga lysates ki te pūmua A + G nga pirepire autō, ka honoa ki te 5 µg o te anti-PACT antibody, ka ata huri i te po i te 4°C.I horoia nga pirepire i nga wa 3 ki te 5 × RIP buffer, e rua nga wa me te 1 × RIP buffer me te whakaheke ki te 1 × SDS buffer.Ko te pūmua kua ora ake i tātarihia e te SDS-PAGE gel ka kitea e WB.
E rua nga pmol o te PACT kua tohua me te 1 pmol o te PKR i purea mai i te E. coli.Waimeha ki roto i te 1× RIP buffer ka whakakororia ki te 10 pmol o te RNA kua whakahouhia mo te 2 haora i te 4 °C.Whai muri i tera, ka whakakororiahia ki te pūmua A+G aukume pirepire-conjugated anti-tapanga antibody mo etahi atu haora e rua.Ka wha nga wa ka horoia nga pirepire ki te 1x RIP buffer, ka rewa ki te 1x SDS buffer.Ko te hua o te PACT me te PKR i kitea e WB.